嗜热侧孢霉

点评 | 朱锦芳（NIH）2022年5月23日，上海交通大学基础医学院生化与分子细胞生物学系童雪梅教授课题组及其合作团队，上海市免疫学研究所李斌研究员课题组和复旦大学附属华山医院/脑科学转化研究院杨辉研究员，在Nature Metabolism杂志在线发表题为 Non-oxidative pentose phosphate pathway controls regulatory T cell function by integrating metabolism and epigenetics 的研究论文，揭示非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）对调节性T（Treg）细胞代谢模式及细胞功能的调控机制。Nature Metabolism同期发表伦敦帝国理工学院Margarita Dominguez-Villar博士为该研究撰写的News & Views特评，认为该文章发现非氧化PPP在Treg细胞活化和功能调控中的中心地位（a central regulator）。表达特征转录因子Foxp3的Treg细胞是一类具有免疫抑制功能的CD4+ T细胞亚群，维持机体免疫系统稳态，防止免疫过激诱发自身免疫病。已知葡萄糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代谢等都参与 Treg 细胞功能调控。PPP是一条不产生ATP的葡萄糖分解代谢途径，由生成NADPH的氧化PPP和产生5-磷酸核糖的非氧化PPP组成。非氧化PPP包括4个代谢酶催化的5步可逆反应，可以通过改变代谢物流向来满足细胞的功能需求。非氧化PPP是否参与免疫细胞如Treg细胞的代谢与功能调控尚不清楚。转酮醇酶TKT是非氧化PPP中催化两步可逆反应的代谢酶。童雪梅团队已发现TKT在肝脏、脂肪和肠道中调控糖脂代谢平衡的重要作用（Li M et al, Cancer Research, 2019 Tian N et al, Diabetes, 2020 Tian N et al, Cell Death & Disease, 2021）。在本研究中，研究人员通过构建Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠模型，深入探究非氧化PPP是否和如何调控Treg细胞代谢及功能。他们研究发现，Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠出生3周后发生严重自身免疫性疾病，并且在断奶之后相继死亡，其表型与缺失Foxp3基因的小鼠相似。进一步研究发现，敲除TKT在不影响Treg数目和转录因子Foxp3 水平的情况下，阻断Treg细胞的免疫抑制功能。为了排除炎症反应的影响，研究者根据Foxp3基因位于X染色体和雌鼠X染色体选择性失活的特点，构建了在同一只鼠中既有TKT缺失又有TKT正常表达的Treg细胞嵌合小鼠模型。该小鼠Treg细胞的转录组和表观遗传组分析表明，TKT缺失导致Treg细胞中87.9%的差异表达基因被下调，染色质可及性降低。这些被下调的基因几乎全部为效应性Treg特征性基因，表明非氧化PPP对调控Treg细胞免疫抑制功能是必需的。研究者进一步发现，TKT缺失导致Treg 细胞NADPH 减少和氧化应激增加，葡萄糖进入线粒体氧化减少，脂肪酸氧化增加，氨基酸分解代谢显著增强，分解代谢重构使线粒体功能受损。同时，被氧化应激和线粒体损伤诱发的还原性TCA循环使α-酮戊二酸/琥珀酸及α-酮戊二酸/富马酸比率降低，DNA甲基化增加，抑制Treg细胞特征性功能基因表达，导致其免疫抑制性功能丧失。文章也发现非氧化PPP中的另外一个代谢酶——转醛醇酶（TAL），对维持效应性Treg特征性功能基因表达也不可或缺。此外，在自身免疫性病人外周血 Treg细胞中，TKT水平显著降低。综上所述，此研究首次揭示非氧化PPP对于调控Treg细胞中糖、脂和蛋白质分解代谢稳态、维持代谢物依赖的表观遗传修饰和功能基因表达有关键作用，即非氧化PPP可以通过整合三大营养物质代谢和表观遗传修饰控制Treg细胞功能。这项研究将为通过调控Treg功能防治自身免疫性疾病和其它免疫相关疾病提供新策略新手段。非氧化 PPP 通过整合代谢组和表观遗传组调控Treg细胞功能上海交通大学医学院博士生刘琪、阿拉巴马大学伯明翰分校博士生朱方明和上海市免疫学研究所博士生刘鑫男是该研究论文的共同第一作者。此项研究得到复旦大学生物医学研究院叶丹研究员、海军军医大学附属长征医院风湿免疫科徐沪济主任、上海交通大学附属仁济医院沈南主任、上海交通大学基础医学院徐天乐教授、清华大学药学院胡泽平研究员、阿拉巴马大学伯明翰分校胡晖教授等合作实验室的大力协助。通讯作者为童雪梅教授、李斌研究员和杨辉研究员。专家点评朱锦芳Jeff Zhu (Chief, Molecular and Cellular Immunoregulation Section, NIH)调节性T细胞（Tregs）在维持免疫耐受和免疫稳态中发挥关键作用，并且参与调节感染和癌症中的各种免疫反应。一方面，Treg功能的丧失通常与自身免疫和过度炎症有关；另一方面，肿瘤微环境中激活的Treg往往会抑制肿瘤免疫。因此，了解Treg的产生、激活及其获得抑制性功能的机制不仅将拓展基础免疫学认知，而且将为各种免疫相关疾病提供新颖有效的临床疗法。不同的代谢途径在控制Treg和效应性辅助型CD4+ T（Th）细胞的发育和分化中作用不同。经典观点认为，Tregs更倾向于脂肪酸氧化，而效应Th细胞主要利用葡萄糖作为能量来源。在本项工作中，童雪梅团队及其合作实验室共同发现，非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）在控制Treg细胞激活和抑制功能中起着关键作用。非氧化PPP是葡萄糖分解代谢的一个分支，它在Treg和效应性Th细胞中的功能尚不清楚。令人惊奇的是，在Treg中敲除非氧化性PPP中的重要酶—转酮醇酶（TKT），小鼠会产生致死性自身免疫病。Treg细胞特异性 TKT 缺失导致其失去免疫抑制功能，却不影响其发育和Foxp3蛋白表达。机制上，童雪梅及其合作团队发现TKT缺失诱导线粒体氧化应激和还原性TCA循环，导致α-酮戊二酸（α-KG）水平降低。α-KG作为重要的表观遗传辅助因子，能调控组蛋白和DNA去甲基化酶的功能。TKT缺失时，Treg中众多基因的DNA甲基化增加，染色质可及性下降。并且，α-KG补充能够改善由Treg特异性TKT 缺失引起的自身免疫反应。此外，在临床自身免疫性疾病患者外周血Treg中，TKT水平被下调。Treg获得抑制功能需要被激活，TKT缺失诱发的自身免疫反应是由活化Treg特征性基因表达减少所导致的。由于Treg细胞群体的异质性，单细胞分析可以为TKT如何调节Treg激活和表观修饰提供一个更清晰的解释。然而，该研究发现在大约1000个激活态Treg特征基因中，只有124个受到TKT缺失的影响，却诱发了显著的小鼠自身免疫病表型，表明这个小的基因群体包含对Treg功能至关重要的效应分子，例如IL-10和TIGIT等。因此，本项研究发现令人印象非常深刻。本项工作不仅促进我们全面认识Treg细胞激活和功能的机理，而且在未来治疗人类疾病方面具有潜在重要转化价值。原文和特评链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00575-z，https://www.nature.com/articles/s42255-022-00574-0

p 　　4月26日，清华大学生命学院、清华 - 北大生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心王宏伟教授研究组在《细胞》(Cell)期刊 发表了题为《人源核酸内切酶 Dicer 蛋白与 Dicer-pre-miRNA 复合体的冷冻电镜结构》(Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate)的研究论文，首次报道了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的全长高分辨率结构，同时还报道了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白结合一种小 RNA 前体 pre-let- 7 底物的两种不同结构状态。 /p p 　　RNA 干扰(RNAi, RNA interference)是敲低一个基因表达的最为常用的一种手段。内源性引起 RNA 干扰的小 RNA 主要是微小 RNA (miRNA)。 到目前为止，人体内已经发现多达 1800 种微小 RNA，越来越多的文献报道认为很多肿瘤的发生发展、转移等行为与微小 RNA 的异常表达密切相关。 /p p 　　人体内绝大部分微小 RNA 成熟形成都离不开一种核酸内切酶，我们称之为 Dicer 的蛋白。有趣的是人体内只有一个拷贝的核酸内切酶 Dicer 基因, 表达唯一的一种人源核酸内切酶 Dicer 蛋白，然而却负责人体内绝大部分微小 RNA 的形成。因此，核酸内切酶 Dicer 蛋白在人体细胞中的重要性不言而喻。核酸内切酶 Dicer 蛋白是一种只切割双链 RNA 底物的内切酶，分子量大小约为 220 kDa，有多个结构域组成。其中有的结构域负责结合 RNA 底物，有些结构域负责切割 RNA 底物，还有些结构域就像一把尺子，精确测量出 RNA 需要被切割的位置。人源核酸内切酶 Dicer 蛋白能够识别细胞内众多不同的微小 RNA 前体底物，然后加工生成具有共同特征的长度约为 22 碱基和 3& #39 末端有两个游离碱基的成熟小 RNA。 /p p 　　遗憾的是, 人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的整体三维结构一直没有得到解析， 人源核酸内切酶 Dicer 蛋白是如何精确加工这些微小 RNA 前体的机制至今仍然不清晰。人源核酸内切酶 Dicer 蛋白一直没有获得高分辨率三维结构的主要原因有几点：1、人源核酸内切酶 Dicer 蛋白约为 220 kDa，对于运用晶体学来获得三维结构来说，分子量比较大，很难结晶 2、对于运用单颗粒重构的方法来获得高分辨率三维结构来说，其分子量又相对较小 3、核酸内切酶 Dicer 蛋白三维结构呈 L 型，没有对称性，在冰中分布多为长条型，衬度低，分布不均匀，有优势取向，对单颗粒三维重构形成了很大的技术障碍。 /p p 　　过去十年的时间里，王宏伟以及其他课题组都尝试运用单颗粒电镜的方法去解析人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的三维结构。经过不断地摸索，研究组解决了蛋白质样本准备、冷冻样本制备、数据收集及处理等多方面的技术难题，最终采用从哺乳动物 293F 细胞系中共表达蛋白复合体，亲和层析分离纯化蛋白质，采用纯金或者镀金载网制备出了分布较为均一、优势取向相对较少的冷冻电镜样品，并获得获得了人源 Dicer 及其辅因子蛋白 TRBP 复合体的高分辨率三维结构(4.4 埃)(图 1)，首次解析了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的高分辨率整体结构，看到了核酸内切酶 Dicer 蛋白中各结构域的精确三维分布及结构域之间的空间关系。 /p p style=" text-align: center" img style=" width: 450px height: 228px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/5bfa629d-b6df-4ffe-ad84-f53dedc3fd4b.jpg" title=" 02.jpg" height=" 228" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 450" / /p p style=" text-align: center " strong 图 1. 冷冻电镜解析获得的人源 Dicer-TRBP 复合体 (TRBP 是一种 RNA 结合蛋白) 高分辨率结构及其结构域分布 /strong /p p 　　为了更进一步了解人源核酸内切酶 Dicer 蛋白是怎样加工微小 RNA 前体的过程，王宏伟研究组通过体外重组的方法获得了人源 Dicer-TRBP 复合体与一种微小 RNA 的前体 pre-let- 7 所形成的三元复合体，并解析了该复合体的两种三维结构状态。一种是 pre-let- 7 的茎部呈完全互补结构(hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class I)，另一种是 pre-let- 7 的茎部呈部分解离的状态(hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class II)(图 2)。王宏伟研究组与清华大学张强锋研究组合作，通过化学修饰测序(icSHAPE)、核糖核酸酶酶切、测序胶电泳等技术，发现 pre-let- 7 在溶液中呈动态的构象平衡，一部分 pre-let- 7 的茎部是完全配对的双链螺旋结构，也有一部分 pre-let- 7 的茎部是呈部分解离的状态。深入的研究表明人源 Dicer 蛋白与 TRBP 形成的复合体与 pre-let- 7 结合可以促进该 RNA 向茎部完全配对的双链螺旋结构转换，确保其茎部在被 Dicer 蛋白切割前的构象均一性，从而保证微小 RNA 产物的精确长度。正是这个机制有可能保证了人源 Dicer 蛋白精确地将众多结构特征不同的微小 RNA 前体切割成具有共同的 22nt 长度的产物。这项工作为进一步解析微小 RNA 的成熟机制奠定了基础。 /p p style=" text-align: center" img style=" width: 450px height: 232px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/06e44afa-a813-46e0-a6cd-89e2c52e89cb.jpg" title=" 03.jpg" height=" 232" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 450" / /p p style=" text-align: center " strong 图 2. 两种 hDicer-TRBP-pre-let- 7 复合体的冷冻电镜结构 /strong /p p 　　在本工作中，王宏伟研究组成员，清华大学生命学院博士后刘忠民、王家、2015 级博士生程航、2015 级博士生柯鑫为共同第一作者，王宏伟教授为本文的通讯作者。另外，清华大学生命学院张强锋教授，生命中心 2013 级孙磊博士开展了 icSHAPE 的实验，为本工作提供了重要的实验证据。本研究获得了清华大学冷冻电镜平台、高性能计算平台和蛋白质分离纯化与鉴定平台的支持，数据处理在国家蛋白质科学(北京)设施清华大学高性能计算平台上进行。 /p p 　　本工作获得了国家自然科学基金委、科技部、北京市科委、生命科学联合中心和北京市结构生物学高精尖创新中心等的大力支持。 /p

p 　　近日，南京大学的鞠熀先教授研究组在仿生分子识别与仿生催化领域取得重要的研究进展。他们发现了一种嗜热型高活性的DNA酶，相关成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.& nbsp 上。博士生郭悦华为第一作者、周俊副教授和鞠熀先教授为通讯作者。该研究组的博士生陈杰林、中科院大连化学物理研究所的博士生程明攀以及法国勃艮第大学的David Monchaud教授参与了相关工作。 /p p 　　蛋白质具有温度敏感性，蛋白酶的催化性能与温度相关，在应用上受到很大的限制。寻找、发现能够在极端环境如高温下仍具有高催化能力、高稳定性的仿生模拟酶具有十分重要的意义。近年来，具有催化活性的纳米结构材料和G-四链体/hemin DNA模拟酶受到广泛的关注，已成为新型仿生模拟酶开发的重点方向。在G-四链体/hemin领域，由分子内G四链体/hemin形成的DNA模拟酶已在生物催化、生物传感等领域得到广泛的应用，但其热稳定性差，无法用于极端环境。基于四条链形成的四元G四链体具有很好的热稳定性，鞠熀先教授课题组通过对四元G四链体的末端进行碱基修饰，并对反应的离子进行筛选，提高了G-四链体/hemin的热稳定性，由此发现一种新型嗜热的高活性G-四链体/hemin DNA酶（图1）。该工作在四元G四链体的末端修饰不同的碱基，发现腺嘌呤（A）可以大幅度提高DNA酶的催化活性，为提高反应温度，模拟酶催化功能如活化能、pH依赖性等的研究奠定了基础。末端修饰腺嘌呤的四元G四链体结构在高温下不仅可以稳定存在，也可保持与hemin的结合能力及形成模拟酶后的催化活性（图2）。该工作探究了嗜热DNA酶在高温下的潜在应用：有效地去除污水中对人体有害的有机小分子，在不同的有机溶液中这种酶也同样具有高催化活性。 /p p br/ /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/99a9239f-4001-48cd-9c10-7d1cd7b9f869.jpg" title=" 1.jpg" / /p p style=" text-align: center" strong 图1. 嗜热G-四链体/hemin DNA酶在不同温度下催化底物反应的示意图 /strong /p p span style=" text-align: center " /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/ce392a11-f046-46e3-866b-49f66466e3e9.jpg" title=" 2.jpg" width=" 600" height=" 466" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 466px " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" text-align: center " 图2. 嗜热G-四链体/hemin DNA酶在不同温度下的催化活性及热稳定性的研究 /span /strong /p p br/ /p p 　　鞠熀先教授课题组专注于仿生分子识别、仿生催化与信号放大的研究，在973计划、国家自然科学基金等项目的资助下提出了多种仿生分子识别体系与信号放大策略，将仿生催化模拟酶用于生物传感，建立了系列性的生物分子高效的检测方法。在G-四链体/hemin领域，他们将其催化活性与该课题组首创的量子点电子化学发光传感结合，提出了蛋白质标志物的超灵敏电致化学发光免疫分析方法；将G-四链体/hemin与临位触接反应结合，建立了DNA与蛋白质标志物多种化学发光成像的检测方法。近日，该组系统地开展该领域的研究工作，提高了G-四链体/hemin DNA酶的活性（Chem. Eur. J.,& nbsp 2017,& nbsp 23, 4210），揭示了G-四链体的构效关系（J. Am. Chem. Soc.,& nbsp 2017,139, 7768）。 /p p br/ /p p 该论文作者为：Yuehua Guo, Jielin Chen, Mingpan Cheng, David Monchaud, Jun Zhou, Huangxian Ju /p