分枝犁头霉

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的一类重大传染性疾病。据世卫组织发布的最新报告，在2020年，全球有近990万结核病患者，并有约151万人因结核感染导致死亡。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来发表系列研究工作，在病原菌与宿主相互作用机制方面取得重要成果，为抗结核治疗及药物研发提供了多种新思路和潜在新靶点。　　以往认为，健康个体受到Mtb感染时，往往会发展成为潜伏感染者或活动性TB患者。有趣的是，近年来临床上发现有一部分与TB患者持续密切接触的个体，既不发展为活动性TB患者并显示出相关症状，也未表现出潜伏感染者的免疫学诊断特征。这类长期密切接触病原菌的健康个体被称作TB抵抗者。　　目前对于这类TB抵抗者的抗感染免疫机制所知甚少，深入揭示相关机制有望为TB的预防和治疗提供新线索和新策略。近日，刘翠华课题组与首都医科大学附属北京胸科医院教授逄宇团队合作，揭示了TB抵抗者人群在应对Mtb感染时的固有免疫应答特征。该合作研究发现：与对照组、潜伏感染者及活动性TB患者相比，TB抵抗者的外周血单核巨噬细胞在受到Mtb侵染时，可产生更高水平的TNF-α、IL-1β及IL-6等细胞因子，并且其清除胞内病原菌的能力更强。　　随后的一系列筛选及功能验证实验结果表明：在Mtb感染过程中，组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）仅在TB抵抗者来源的巨噬细胞中维持稳定的表达水平及酶活性，而在其他实验组人群中出现显著下降。同时，进一步抑制或沉默HDAC6可阻抑TB抵抗者来源巨噬细胞中细胞因子的分泌以及其中含Mtb的囊泡的酸化能力。这些结果提示，TB抵抗者来源的巨噬细胞高效清除Mtb感染的能力依赖于HDAC6，后者可能是一个促进细胞因子产生以及自噬流畅通进而加速Mtb清除的关键宿主因子。综上，该研究揭示了TB抵抗者人群依赖HDAC6清除Mtb感染的固有免疫新机制，为临床上TB患者密切接触者的TB感染和发病风险预测提供了重要新标识，并为靶向宿主的TB治疗提供了新思路。　　目前，相关结果已在线发表于The FASEB Journal。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金及北京市医院管理中心“扬帆”项目的支持。　　论文链接

01研究背景膜蛋白生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点，而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点：1. 膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术，去垢剂会增加背景信号，或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。2. 膜蛋白结构复杂，且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时，膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程，或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。3. 膜蛋白的表达量低、纯化难，因此需要消耗量少的方法进行检测。本期文献解读，讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。02研究内容2024年3月15日，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构，为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析，推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点，并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。Rv3806c为膜蛋白，并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行Kd检测，每次实验均进行了5次重复。MST进行一次亲和力检测时，仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c，大大节约蛋白消耗量。此外，MST技术是在溶液条件下进行，无需固定，且兼容去垢剂，使膜蛋白能保持正确的构象，甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测，从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。图示：MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力此外，研究发现，供体底物PRPP通过一个Mg2+结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg2+对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用，作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg2+时，Rv3806c与底物PRPP的结合。NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构，无需加入外源荧光染料，兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验，结果显示Mg2+对于PRPP的结合至关重要。图示：MST分析在Mg2+存在或不存在的情况下，PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg2+的情况下，结合亲和力急剧下降，而在金属螯合剂EDTA的存在下，没有检测到结合。图示：在Mg2+、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下，纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg2+存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。03技术优势在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基，以及Mg2+在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器无需固定样品，且不限制缓冲条件，蛋白用量少，可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，无需外源荧光染料，兼容去垢剂，低浓度也可轻松表征，在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。-Monolith分子互作检测仪--PR Panta蛋白稳定性分析仪-

面对出土四千年前的铜器，人们不由得心生敬意。这些中国文明最早的遗存尽管遭受岁月的侵蚀，改换了面目，但借助现代科技和仪器，它们所携带的文化和技术基因，却能够清晰地呈现在现代人面前。　　“学会冶炼铜，是人类进入文明时代的一项重要标志。因为铜的冶炼铸造非常复杂，不是小打小闹，复杂化的社会才能支撑。”北京科技大学冶金与材料史研究所所长梅建军说，铜的冶炼需要一个专业的工匠阶层来操作，这只有生产力很发达的时候才能实现。中国商代拥有灿烂的青铜文明。而中国复杂的冶铜技术是如何起源和演变的，人们知道得很少。　　最近几年，在国家文物局的重视和指导下，“文化遗产保护关键技术研究”、“中华文明探源工程”、“指南针计划专项”等一批重大科研项目的组织实施，科技人员在冶金技术起源以及金属与矿冶文化遗产的保护方面，取得了一批重要成果。在保护文物完整的前提下，一些我国早期金属器物携带的宝贵信息陆续被人们所知，这为揭示中国早期冶金技术的演变提供了线索。　　作为近年来参与此项工作的专家之一，梅建军告诉记者：“我们主要研究三类对象：一是考古发掘出土的早期铜器；二是在考古遗址上发掘出土的或采集的矿冶遗物，主要是冶炼炉渣及冶炼的中间制品；三是发掘出土的或采集的铸范资料，包括石范和陶范。研究的绝大多数标本和样品的年代，均落在公元前2300年至公元前1500年间。”　　从古代地层里掘出的那些颜色晦暗的金属渣，很不起眼，却有助于回答中国金属文明的起源。“以前考古上主要关注的是出土的铜器，现在我们对冶炼遗址研究也投入了很大精力。”梅建军说。　　研究人员利用金相显微镜和扫描电子显微镜等理化分析手段，来检测特定地区出土青铜器和冶铸遗物的成分及显微组织等。　　在那些宛如现代抽象美术，或遥感图像的金相组织照片里，色块和线条截然不同的组合，透露出不同的铸造和锻造工艺。　　通过探讨各地区冶铜技术和青铜合金配比等冶铸工艺，以及铜器的制作加工工艺、陶范和坩埚材料的选择和制作技术，研究者就可以归纳、总结和比较各地区早期冶金技术发展的特点。　　比如说，位于河南偃师二里头村的二里头遗址发掘出的大量铜器，以及铸铜遗址出土的陶范、石范、坩埚和炼渣等遗物，就在现代仪器的侦测下，吐露出一些重要信息。　　科技人员分析了30件铜器标本和6件铜渣标本。现代科技揭示了这些铜质文物的内涵：22件铜器是铸造品，另外8件的金相组织表明它们经过了加工。从成分上看，铜器中有纯铜、砷青铜、锡砷青铜、铅锡砷青铜、锡青铜和铅锡青铜等6种材质。　　对铜渣样品进行金相组织分析后，科技人员得出以下认识：二里头遗址的出土铜器，虽然对铜、铅、锡和砷的配比与金属器物功能的关系有一定认识，但合金比例不稳定，当时锡和铅已经有意识地加入。　　二里头遗址的年代在公元前1780年到1529年，正好在商代之前。人们认识到，中原地区在合金熔炼、合范铸造等方面，在二里头时期已经达到了较高的水平。　　包括二里头文化遗址在内，研究人员总共分析了分别出自中原、北方和西北的18处早期文化遗址。其中，西北地区出土的金属文物是分析数量最多的。研究人员发现，多属于齐家文化的这些铜器材料和工艺十分丰富，这进一步表明西北地区在中国早期冶金发展的进程中，扮演了十分关键的角色西北地区铜器技术创新十分活跃，对于中原和北方有明显影响。　　先进的仪器不光能金属器物本身的性质，还有可能说清它的材料来源。“比如我们可以对青铜里的铅做同位素分析，看铅是从哪个矿区运来的。”梅建军说。这样就有助于我们了解从采矿地到冶炼地，再到使用地的路径。现在这一类工作还在继续，更多重要的历史秘密将被揭示。　　随着先进科技手段的普及（主要是各种光学仪器的应用），近年来发现的很多铜采冶遗址，就具备了更高的价值。据梅建军介绍，加强对生产性遗址的重视，整合研究与保护功能，已成为早期金属文物保护的必然思路。