休哈塔假丝酵母休哈塔亚种

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 　　酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。　　酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。　　根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了　　酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。　　基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能　　酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。　　2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。　　3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响　　酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。　　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

[b]1. 目的[/b] 对《食品安全国家标准 食品生生物学检验 霉菌和酵母计数》GB4789.15-2016进行细化，指导微生物实验室霉菌和酵母计数检测具体操作。[b]2. 适用范围[/b]本操作规程适用于食品、化妆品及一次性筷子中霉菌和酵母菌的计数。[b]3. 设备及材料[/b]冰箱、霉菌培养箱、拍击式均质、显微镜、电子天平、高压灭菌器及其他灭菌和常规检测用器皿、材料。[b]4. 培养基及试剂[/b] 生理盐水（0.85%氯化钠溶液） 孟加拉红培养基或马铃薯葡萄粮琼脂[b]5. 检验程序 [/b] [table][tr][td=1,1,35] [/td][/tr][tr][td] [/td][td][img=,527,469]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181712248843_5332_3247208_3.png[/img][/td][/tr][/table][b] 6. 操作步骤6.1 1:10样品匀液制 [/b]以生理盐水做样品稀释液。6.1.1食品样品 样品适宜时，取25g/ml样品加入装有225ml稀释液的均质袋中，用拍击式均质器充分混匀；如果样品硬度较大，不宜使用拍击式均质器时，取25g样品加入装有225ml稀释液的椎形瓶中充分振摇，制成1:10样品匀液。6.1.2 化妆品样品 油性液体，取10g/ml样品，先加入5ml灭菌石腊混匀，再加10 ml灭菌吐温80，42℃水浴，加75ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液； 水溶性液体、膏、霜、粉剂等，称10 g样品加90ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液 疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10 g/ml样品加10 ml灭菌液体腊和10 ml灭菌吐温80，再加入70 ml灭菌生理盐水，拍击均质3 min，制成1：10样品匀液。6.1.3 一次性筷子样品 取一次性筷子25g（通常取6双，表面积约为50平方厘米）加入装有225ml稀释液的无菌袋中充分振摇，作为1:10的样品匀液。[b]6.2 样品匀液稀释[/b]用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]取1ml 1:10的样品匀液注入装有9ml稀释液的试管中，另换一个枪头，反复吹吸，制成1:100样品匀液。按此法依次制备10倍递增稀释的系列样品匀液。根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入2个无菌平皿内。同进分别取1ml样品稀释液加入2个平皿作空白对照。[b]6.3 倾注平皿[/b] 将冷却至46℃的孟加拉红培养基倾注平皿，及时转动平皿使培养基和样品匀液混合均匀。[b]注意：[/b]孟加拉红培养基可置46±1℃的水浴箱中保温，但不应超过4小时。凝固后的培养基只可复溶一次，否则将影响培养基质量。[b]6.4 培养[/b] 待琼脂凝固后，将平皿倒置，于28±1℃霉菌培养，3天后观观察，5天记录结果。[b]6.5 计数[/b] 肉眼观察，选取菌落数在10-150CFU的平板计数。根据检测要求，计数霉菌和酵母的总和或分别计数霉菌数和酵母数。霉菌、酵母和细菌的菌落鉴别可参照以下方法。[align=left]6.5.1肉眼观察菌落特征[/align][align=left]通常情况下肉眼观察，霉菌、酵母、细菌三种菌落在孟加拉红培基上的特征如下：[/align] [table][tr][td=1,1,83] 霉菌菌落[/td][td=1,1,482] 绒毛状、棉絮状、蛛网状。具有菌丝体，菌落较大，扁平，较干燥。颜色多样，白色、黑色、黄色多见，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致，菌落周围有晕圈。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 酵母菌菌落[/td][td=1,1,482] 菌落较细菌大且厚，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色均一。光滑、湿润、常带黏性，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。培养时间较长时可呈皱缩状，表面较干燥。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 细菌菌落[/td][td=1,1,482] 由于受到抑制，通常会很小，红色，常呈橄榄形。[/td][/tr][/table]6.5.2 低倍镜观察菌落边缘形态肉眼观察菌落形态无法区别孟加拉红培养基上酵母和细菌时，可用低倍普通光学显微镜观察平板表面菌落边缘较薄较透光的部分，在边缘能看到细胞的是酵母，看不见的则是细菌。 [table=565][tr][td=1,1,83] 霉菌菌落[/td][td=1,1,482] 边缘可见明显的菌丝体。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 酵母菌菌落[/td][td=1,1,482] 边缘较规整，调节聚焦螺旋可见到细腻如细沙的结构。若无法确认可用接种针从边缘稍稍刮开菌落，即可在镜下见到卵圆形的细胞。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 细菌菌落[/td][td=1,1,482] 菌落紧密，边缘整齐，不易透光，看不到细沙粒样的结构。[/td][/tr][/table]6.5.3 染色法观察挑取菌落用亚甲基蓝或革兰氏染色，酵母菌霉菌在低倍镜下即可见到细胞或菌丝，而细菌不可见，无菌丝的酵母体积较大，在40倍显微镜下清晰可见，细菌则需在油镜下才能清楚观察。[b]7. 结果记录与报告[/b]7.1 结果记录计算两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数计算。7.1.1 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他夹板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.2 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.3 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。7.2 报告7.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。7.2.2 菌落数大于或等于100时，可将前3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前两位数字，后面用0补齐位数表示结果（例如：结果为1210可表示为1200）；也可采用两位有效数字乘以10的指数形式来表示（例如：结果为1210可表示为1.2*10[sup]3[/sup]）。7.2.3 称重取样以CFU/g为单位，体积取样以CFU/ml为单位。7.2.4 根据检测要求分别报告霉菌和酵母数，或报告霉菌和酵母总数。[b]8. 参考文件[/b]《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》 GB 4789.15-2016《一次性筷子 第1部分 木筷》 GB19790-2005《化妆品微生物标准检验方法》 GB 7918-1987

【中文名称】饲料酵母【英文名称】feed yeast【性状】 黄色粉末。有特殊香味。【用途】 在饲料中作蛋白源，在鸡饲料中添加4%，相当鱼粉的效果。【制备或来源】 将黄粉（或味精废液）用酵母菌培养，制得的菌体与培养基混合，再经脱水，干燥制得。【其他】 含粗蛋白65%以上，并含有18种氨基酸，其中8种是动物必须氨基酸。另外含有磷、钾、钙、镁等微量元素及多种维生素。【生产单位】 浙江义乌糖厂；山东省科学院生物研究所；山东省莱州酵母厂；