指纹标记

自上世纪80年代首次作为法医工具以来，DNA分析已成为刑事审判中证据分析的金标准。早期的法医科学家使用限制性片段长度多态性(RFLP)分析来比较犯罪嫌疑人的图谱。而最近，核酸纯化和扩增技术的改进让人们更容易从较少的样本材料中获得可靠的DNA图谱。新一代测序(NGS)技术正在鉴定出新的靶点，它们将产生更加特异的标记，并通过集中式数据库收集和共享这些数据。 　　指纹识别 　　由于简便，PCR非常适合法医分析，因为它带来了极致的检测灵敏度，并且能够快速生成基因型，让研究人员在几小时内确定或排除嫌疑人。然而，那些处理样本的人或犯罪现场中其他人的污染，可能使结果难以解释。DNA量有限，这也是个问题。 　　澳大利亚弗林德斯大学的Jennifer Templeton和Adrian Linacre最近解决了这些问题1。在《BioTechniques》上发表的研究中，他们利用直接PCR来分析所采集指纹拭子的DNA。这回，他们分析的是短串联重复序列(STR)。&ldquo DNA总是潜伏在你看不见的地方，比如门把手、刀柄等。目前，即使你采用最好的方法来提取DNA，也会损失80%，这样你就没有足够的模板来做任何事情。唯一的方法是增加循环数，但许多实验室不喜欢这样做，&rdquo Linacre谈道。 　　有些人也正通过增加循环数来扩增指纹DNA，不过这容易引入错误，造成靶点的错误检测以及杂合子中靶点的过度扩增。Templeton和Linacre决定对指纹拭子的DNA进行直接PCR，这些指纹来自34名志愿者的5个手指。他们发现，利用ProfilerPlus和NGM Select STR分型试剂盒，170个拭子中有71%能产生可解释的STR图谱。生物通 www.ebiotrade.com 　　Linacre的这个想法来源自他们之前的工作，从人的头发中产生STR图谱。&ldquo 如果你能拿到头发顶端的2 mm，那么每根头发都能产生完整的图谱。这让我想到，我们也可以试试指纹，&rdquo 他说。 　　Linacre的小组利用带正电荷的拭子来采集带负电荷的DNA。这种方法很有效，让研究人员并不需要提取DNA。他们只需要将拭子上的纤维放入PCR管中，并按照建议的PCR循环数来生成STR图谱。 　　&ldquo 我们选择这样做，是因为法医实验室目前正使用商业化的试剂盒，这会比较容易实现，&rdquo Linacre谈道。&ldquo 同时，这也减少了污染的可能性，并大大降低了成本。&rdquo 　　简单又优雅 　　虽然Templeton和Linacre的技术算不上新颖，但其他的分子法医专家也看到了这种方法的优势。例如，北德克萨斯大学健康科学中心的Bruce Budowle提到，&ldquo 之前人们利用直接PCR来扩增血斑，循环数通常比较少，因为血液DNA较多。[Linacre]也采用同样的原理。对于样本量少的材料，如指纹，一旦你放入体积很小的溶液中，它就会浓缩很多。&rdquo 浓缩的样本减少了错误。 　　加拿大皇家骑警队的Ron Fourney形容Templeton和Linacre的工作是&ldquo 老树开新花。但他们并不害怕冒险，而是勇敢尝试一些不同的东西。他们用Triton-X 100处理拭子上的指纹。不过他们成功的真正秘诀在于技术发展得如此之快。十年前甚至五年前，他们可能根本不会有结果。他们的方法简单又优雅，因为他们不需要纯化，这样在分析过程中损失宝贵DNA或引入外源DNA的风险就降低。&rdquo 他补充说，&ldquo 我认为直接PCR将会是今后许多法医DNA分析过程所采用的方式。&rdquo 　　未来的潮流? 　　PCR对NGS而言必不可少，因为大多数平台依赖扩增的步骤。随着NGS的应用更加广泛，它必将成为法医实验室的核心部分，而直接PCR也将是联系犯罪现场样本和嫌疑人DNA之间的纽带。 　　Budowle认为，临床测序不可能跨越PCR，成为法医学工具。&ldquo NGS有优势，但周转起来比较慢。&rdquo 不过，NGS在鉴定标记上很有价值，这将改善PCR在个性化上的潜力。 　　Fourney认为NGS和PCR是取代性的技术。&ldquo 这是第一次，快速的基因组分析趋向于一种自动化的易用技术，且成本相对低廉，&rdquo 他说。他预计，不久以后测序整个基因组将变得比测序线粒体DNA标记或传统的STR分析更轻松、更快速，也更便宜。 　　&ldquo 法医学未来面临的挑战将与临床诊断相似：我们有这么多的数据，我们要如何解释和关注最重要的?此外，还有许多竞争性和同样重要的要求，如隐私和信息安全，&rdquo Fourney指出。

指纹破案不准确　　近代以来，指纹是识别罪犯的一个重要依据，不过，由于比对标准仅仅是嫌疑人指纹与现场采集到的指纹的相似性，而现场采集的指纹往往多而杂乱或者不完整、不清晰，这就难免有误判了。　　1997年初，英国一名51岁的男子被杀死在家中，警察根据在死者家中发现的指纹找到了嫌疑人大卫阿斯伯里，他曾被受害者雇佣到家里做过一些杂活，警察还在阿斯伯里的家里发现了一个有受害者指纹的存钱罐。但奇怪的是，在受害者家里的门框上警察还发现了另一枚指纹，这枚指纹与警官雪莉麦基的很相似。雪莉麦基坚决否认自己曾到过受害者家中，她的警察同事也给她提供了一些不在场证明。但是为了证明指纹识别是准确的，阿斯伯里确实是犯人，雪莉被判定说了谎，她不仅被解雇了，还和阿斯伯里一同入狱了。几年后，案件重审，来自不同国家的171名指纹专家再次复审了指纹，他们得出的结论是雪莉的指纹与犯罪现场的指纹并不匹配，于是雪莉和证据并不充分的无辜的阿斯伯里最终得以获释。　　雪莉的冤案并不是独一无二的。2004年，西班牙马德里的地铁遭到爆炸袭击。警方在现场采集到一个不完整的指纹，两个月后，美国警察逮捕了“犯人”，他们宣称这个叫布兰登梅菲尔德的人的指纹与爆炸现场的指纹相吻合，尽管他有确切的不在场证明。又过了半个多月，西班牙警方逮捕了另一名犯罪嫌疑人，这名嫌疑人的指纹与现场指纹更吻合，无辜的梅菲尔德才被释放。　　虽然指纹确实很独特，但很显然，仅凭形状比对不能保证百分百的准确性。不过，现在科学家对指纹有了更新、更深的认识。　　原有物质跑不掉　　每个人指纹下方的皮肤藏着许多汗腺和毛孔，它们分泌出的氨基酸和脂肪酸会留在指纹的沟壑间，而不同性别和年龄的人分泌的氨基酸和脂肪酸的量是有差异的，随着时间的流逝，这些物质的含量也会发生变化，指纹告诉我们的秘密就藏在这些变化后。　　从指纹看性别现在已经非常容易了，科学家们发现，男性和女性指纹中的异亮氨酸、苯丙氨酸和棕榈油酸的含量存在明显差异。在多个实验样本中，男性的指纹中上述三种物质含量均比女性高，平均约高出10%～30%，结合三种物质含量来判断性别，准确率高达90%。年龄也与指纹的化学成分密切相关，儿童的指纹中含有较高浓度的挥发性未酯化脂肪酸（能直接供能的物质，如油酸、软脂酸等），而成人含有较高浓度的、挥发性较差的酯化脂肪酸（脂肪酸与醇的反应产物，参与构成其他物质，如卵磷脂、脑磷脂等）。科学家们已经算出了一个指纹中的化学成分随年龄变化的函数公式，将相应化合物的含量代入公式，就能算出指纹所有人的年龄。　　基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MSI）是目前最常用的确定指纹化学成分的方法，氨基酸和脂肪酸的含量都能用该方法测出来。美国爱荷华州立大学的化学家佩吉辛纳斯还能通过脂肪酸的剩余含量判断出指纹被留下的时间，最长可以追溯到15天前。当一枚指纹被留在空气中时，其中的不饱和脂肪酸会与空气中的臭氧反应发生降解。指纹留下时间不同，降解物质的种类和含量会发生变化，这样科学家就能够通过质谱仪分析降解物质的变化，来判断指纹的“离体时间”，也即刑事案件中的作案时间。　　外来物质全知道　　除了自身分泌的物质外，指纹还能“拦截”一些外来物质，比如日常接触的药物、酒精甚至是血液，而这些东西对案件的侦破至关重要。　　英国东英吉利大学的研究人员开发了一种检测人手指上的药物的方法，目前能检测四类药物：大麻、可卡因、冰毒和鸦片。人们将手指按压在药物筛选盒里的试纸上，如果被检测的四类药物存在，试纸上的荧光标记抗体会与药物结合，药物含量越多，结合抗体越多，荧光就越弱，如果四种药物都不存在，将获得最大荧光信号，最后通过测量荧光信号就能知道人们接触毒品的情况。该方法能够检测低至10-9克级的药物，只需要10分钟就能得到结果。　　而且，这个方法同样能应用于死者。研究人员从75名癌症致死的死者身上获取了指纹样本，检测到他们生前曾大量服用吗啡，这是癌痛的镇痛药物之一。因此，如果这个技术能用于刑侦，对判断死因和确认嫌疑人是否是瘾君子将有重要作用。自2012年起，英国谢菲尔德哈莱姆大学的生化学家西蒙娜弗朗西丝团队就与警方合作，研究指纹识别技术在刑侦活动中的应用，现在他们已经能用质谱法在指纹中鉴定出多种分子，比如毒品、血液、化妆品成分以及咖啡品种等，根据这些信息，警方能大大缩小嫌疑人的范围。　　研究人员是这样运用质谱仪来检测指纹中血液的存在的。血红蛋白是血液中负责氧运输的蛋白质，其中的一种化合物——血红素含有许多结合氧气所必需的铁元素。在质谱仪中，极微量的铁元素也能被识别出来，还能判断这些铁元素是否来自血液，来源是动物血液还是人类血液，甚至连几十年前采集的指纹中隐藏的血液也能被检测出来。有了这项技术，尘封几十年的案件将迎来新的突破。　　想象一下这幅画面：刑侦警察们坐在电脑前，屏幕上放映着一个嫌疑人的指纹，它属于美国某州某县的一个30岁的男子，他清晨爱喝蓝山咖啡，每天会抽两支万宝路香烟，日常使用古龙香水，根据指纹中的印刷墨水，可判断他在一家高科技公司工作… … 只需要几分钟，警察们就获得了这么多信息，犯人们还能藏多久？

在现代生物医学研究中，流式细胞术（Flow Cytometry）已经成为不可或缺的分析工具。它能够通过分析单细胞的多参数特性，揭示细胞间的复杂异质性。而在这一领域，流式细胞指纹（Flow Cytometry Fingerprint）作为一种前沿技术，正在为我们揭示细胞微观世界的更多奥秘。本期，我们跟随贝克曼库尔特一同探究流式细胞指纹，特别是在纳米流式领域，CytoFLEX nano凭借其独特的技术优势，正在引领这一领域的进展。 什么是流式细胞指纹？流式细胞指纹是指通过流式细胞术获得的细胞或颗粒的特定光学特征，这些特征包括散射光和荧光信号。每一种细胞或颗粒都有其独特的指纹图谱，这些图谱反映了它们的物理和生物化学特性。通过对这些指纹图谱的分析，研究人员能够识别并分类不同类型的细胞，甚至可以在同一细胞群体中发现不同的亚群。传统纳米流式在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）领域的挑战尽管流式细胞术在细胞分析中取得了巨大进展，但在传统纳米流式领域仍面临一些独特的挑战。一个主要问题是缺乏免疫分型的共识，并且同时检测的荧光信号非常有限。目前，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）亚群的研究还在起步阶段，并没有像免疫学中那样成熟。免疫细胞可以通过多色免疫分析，利用不同的CD分子的表达谱型（指纹）去定义其亚群，但在EV的研究中，类似的标记和分类标准尚未建立,并且相较于免疫细胞，EV有着更丰富的多样性，可供标记的潜在靶点也更多。 CytoFLEX nano的突破2024年3月份发布的CytoFLEX nano作为一款先进的纳米流式细胞仪（查看：3i流式新品|贝克曼库尔特发布CytoFLEX nano纳米流式分析仪），通过结合散射光和荧光信号的综合分析，显著提高了检测的准确性和灵敏度。CytoFLEX nano纳米流式分析仪品牌：贝克曼库尔特型号：CytoFLEX6荧光通道检测能力，实现精准指纹描述CytoFLEX nano能够同时检测6 个荧光通道，提供更加全面和详细的EV荧光指纹信息。5散射光通道检测能力，释放无限潜力CytoFLEX nano分析仪通过提供5个侧向散射通道扩展了您的研究可能性。通过分析不同散射的比率来研究新群体，而无需依赖染料进行鉴定或分离。这种创新方法不仅提高了实验的灵活性和精度，还为细胞外囊泡研究提供了新的可能性和洞察力。CytoFLEX nano分析仪无疑是未来EV多样性研究的重要工具。高灵敏度，确保捕捉每一个潜在的实验现象与信号在一个细胞外囊泡（EV）上，可能只有10个抗原的拷贝，而目前的流式细胞仪无法测量如此少量的抗原。CytoFLEX nano流式细胞仪的主要优势在于其改进的散射和荧光灵敏度，使得可以测量更小的颗粒并检测低密度的抗原。高阶算法应用：利用Cytobank解析EV“指纹”高阶算法的引入为细胞外囊泡（EV）研究带来了一定的变化。Cytobank平台提供了一系列强大的高阶数据分析工具，如ViSNE、FlowSOM、SPADE和CITRUS，这些工具能够高效解析流式细胞数据，揭示复杂的生物学特征。这些高阶算法在解析EV“指纹”中的应用，使得研究人员能够更精准地解析流式细胞数据，发现传统方法难以识别的细微差异。例如：癌症诊断：利用ViSNE分析癌症患者血液中的EV，发现特定的EV亚群与癌症类型和阶段相关联，为早期诊断和个性化治疗提供了新的生物标志物。心血管疾病研究：通过FlowSOM聚类分析心血管疾病患者的EV数据，识别出与疾病进展相关的特定EV亚群，为疾病机制研究提供了重要线索。免疫监测：利用SPADE分析免疫治疗前后患者的EV变化，揭示免疫反应的动态过程，为评估治疗效果提供了新的视角。差异分析：使用CITRUS对不同病理状态下的EV进行差异分析，发现与疾病相关的特定细胞亚群，帮助识别潜在的生物标志物。von Lersner, Ariana K., et al. "Multiparametric single-vesicle flow cytometry resolves extracellular vesicle heterogeneity and reveals selective regulation of biogenesis and cargo distribution." ACS nano 18.15 (2024):10464-10484.所见即所得，利用CytoFLEX SRT实现分选与分析的相互验证。CytoFLEX nano不仅让研究人员能够在EV分析阶段实现“所见”，更通过CytoFLEX SRT的精确分选功能，将这些识别出的EV亚群进行进一步的分选和深入分析，实现“所得”。这种协同工作流程，确保了数据的准确性和可靠性。CytoFLEX nano与CytoFLEX SRT的结合，为EV研究提供了一个强大的工具组合。前者通过高灵敏度的多通道检测，实现对细胞群体的初步识别；后者则通过精准的分选功能，对这些群体进行进一步的验证和分析。这一协同工作流程，使研究人员能够在分子水平上揭示EV的复杂特征和生物学功能，开拓新的研究领域和应用前景。通过这种多种方法的联动，科学家们能够更全面地理解EV的特性，从而在疾病诊断、治疗和预防中发挥更大的作用。CytoFLEX nano和CytoFLEX SRT的完美结合，真正实现了分选与分析的相互验证，尽可能捕捉到每一个潜在的EV亚群。John Tigges, DirectorFlow Cytometry Core Facility and Center for Extracellular Vesicle Detection, Beth lsrael Deaconess Medical Center“Having all these scatters at hand together with the greater sensitivity gives you the power to ask, what could I do now?lt opens up new research possibilities.“拥有这些散射通道以及更高的灵敏度，让你可以问自己，我现在还能做些什么?这开启了新的研究可能性。” 数据示例通过流式分选验证散射光流式细胞指纹的真实性在细胞外囊泡（EVs）的研究中，准确识别和表征其特性是至关重要的。使用CytoFLEX Nano流式细胞仪，我们能够通过高灵敏度的散射光检测捕捉到EVs的初步指纹信号。然而，为了验证这些散射光指纹的真实性，我们进一步利用CytoFLEX SRT进行精确分选。通过分选前后的对比分析，并使用标准微球验证散射光信号的差异，我们确保了这些指纹的准确性和可靠性。使用CytoFLEX SRT对在CytoFLEX Nano上观察到的不同散射差异信号进行分选，并通过回测确认这些差异的真实存在。同时，CytoFLEX SRT的精确分选功能也得到了验证。 结语CytoFLEX家族和Cytobank的结合，为细胞外囊泡（EVs）研究提供了一个强大且全面的分析工具组合。通过纳米流式细胞术，研究人员能够捕捉到EVs的复杂指纹信号，并通过精确分选技术，进一步验证和深入分析这些信号的真实性。这种多方法学联动，不仅提高了数据的准确性和可靠性，还揭示了EVs在不同生理和病理状态下的潜在作用。高灵敏度的散射光和荧光检测能力，加上Cytobank平台的高阶算法，使得研究人员能够更全面地理解EVs的特性，从而在疾病诊断、治疗和预防中发挥更大的作用。通过这些先进技术的应用，EVs研究已经进入了一个新的纪元，开创了更多的研究领域和应用前景。CytoFLEX nano和CytoFLEX SRT的完美结合，为现代生物医学研究带来了前所未有的便利和创新。未来，我们有理由相信，随着技术的不断进步和应用的不断深入，流式细胞术将继续在EVs研究中发挥关键作用，为生命科学的探索开辟更多可能性。贝克曼库尔特CytoFLEX SRT桌面型流式细胞分选仪品牌：贝克曼库尔特型号：CytoFLEX