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原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑——噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速检查、分离并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体数量增加。采用生物测定法进行噬菌体检查,约需12h,因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染,以便采取必要的防范措施。根据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮,可以进行噬菌体检查。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个噬菌斑,故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数,计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因而被广泛应用。
[font=宋体]噬菌体展示技术是一种筛选技术,通过基因工程技术将外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌体,进行多轮筛选,最终在体外获得具有高特异性和高亲和力的重组抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]噬菌体展示技术原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体展示技术[/b][/url]([/font][font=Calibri]phage display[/font][font=宋体])是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框能正确表达,使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白,随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面,可以保持相对的空间结构和生物活性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后利用靶分子,采用合适的淘洗方法,洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体,中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增,经过[/font][font=Calibri]3-5[/font][font=宋体]轮的富集,逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例,最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]噬菌体抗体库的构建和筛选技术流程:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体展示技术中,[/font][font=Calibri]M13[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]f1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]fd[/font][font=宋体]噬菌体是最常用的噬菌体,属于[/font][font=Calibri]Ff[/font][font=宋体]家族。与展示密切相关的有两种结构蛋白质:主要衣壳蛋白[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体](或[/font][font=Calibri]gp8[/font][font=宋体])和次要衣壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体](或[/font][font=Calibri]gp3[/font][font=宋体])。[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]含有[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]个拷贝,以较低的价态存在; [/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]含有[/font][font=Calibri]2700[/font][font=宋体]个拷贝,以较高的价态存在。因此,[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]有利于筛选具有较高亲和力的配体,[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]可用于筛选具有较低亲和力的配体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]该技术实现了基因型与表型的统一,目的基因(粉红色)被克隆至噬菌体[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]基因,其产物(抗体、肽)以融合蛋白的形式展示到噬菌体的表面。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体展示技术的筛选过程包括:[/font][font=宋体][font=宋体]([/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体])一个包含[/font][font=Calibri]106~1011[/font][font=宋体]个克隆的噬菌体文库与包被抗原孵育。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]([/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体])清洗并除去未结合的噬菌体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]([/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体])洗脱与抗原结合的噬菌体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]([/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体])洗脱下来的噬菌体在辅助噬菌体的帮助下感染大肠杆菌从而扩增洗脱下来的候选噬菌体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]([/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体])将细胞接种到可筛选的平板上并进行扩增。以上步骤重复[/font][font=Calibri]2-3[/font][font=宋体]次,使得与目标抗原结合噬菌体被富集。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供噬菌体抗体库技术平台,包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤,义翘神州利用灵活的筛选策略、多种筛选方法以及上清介入检测,筛选的成功率达到[/font][font=Calibri]90%[/font][font=宋体],可根据客户的特殊需求构建不同物种的噬菌体抗体库,并提供全面高效的抗体发现服务。详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/phage-display[/font][/font][font=宋体] [/font]
噬菌体的主要作用是()。 A、噬菌体的分型鉴定 B、杀灭细菌 C、繁殖 D、A+C