碰撞变形

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 近日，玛莎拉蒂撞宝马事故引起社会高度关注。据报道，7月3日晚，河南省永城市一玛莎拉蒂汽车与8车发生剐蹭后逃逸，逃逸中又追尾一辆宝马车致其燃烧，事故共导致2死4伤。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 201px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/6590b45c-238c-4f88-990a-99d4a444f7b0.jpg" title=" 1562732412063.jpg" alt=" 1562732412063.jpg" width=" 300" height=" 201" border=" 0" vspace=" 0" / img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 201px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/382c584e-315f-4878-82d4-4c63a8ee109c.jpg" title=" 1562736025099.jpg" alt=" 1562736025099.jpg" width=" 300" height=" 201" border=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　在本次事故中，除了“豪车”、“富二代”、“醉驾”、“强行逃逸”这些容易引发舆论焦点的关键词之外，“宝马被撞后瞬间燃烧”也引起了公众的高度关注。价值近300万的宝马760轿车，在已经刹车的情况下，被超过120公里时速的玛莎拉蒂撞击后，瞬间燃烧成火球并导致宝马车内后排两人不幸身亡，驾驶员深度烧伤。 /p p span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 　　全球四大汽车碰撞测试机构 /strong /span /p p 　　据官方数据显示，全世界每年因交通事故死亡人数高达约125万。为了减轻因交通事故而引起的伤亡，部分国家或地区建立了汽车碰撞机构，以检测汽车的碰撞系数，尽可能的防止安全不达标的车辆流入市场，从源头上杜绝“劣质”产品。目前全球比较权威的汽车碰撞测试机构主要有以下几家： /p p 　　 strong 1、中国C-NCAP /strong br/ /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/9a7dda16-ea1f-45f1-ba26-4dd79c6b5fdf.jpg" title=" logo_c-ncap.png" alt=" logo_c-ncap.png" / /strong /span /p p 　 /p p 　　 strong 2、欧洲E-NCAP /strong /p p style=" text-align: center " strong img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 250px height: 160px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/1305a1ee-db1e-45ab-a04e-c701b4d01ea5.jpg" title=" u=1183268844,3570561062& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" alt=" u=1183268844,3570561062& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" width=" 250" height=" 160" border=" 0" vspace=" 0" / /strong /p p 　　 /p p 　　 strong 3、美国IIHS /strong /p p style=" text-align: center " strong img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 250px height: 155px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/a009ed4f-013c-4241-92bb-91208d632228.jpg" title=" u=4118967668,1510880071& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" alt=" u=4118967668,1510880071& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" width=" 250" height=" 155" border=" 0" vspace=" 0" / /strong /p p 　　 /p p 　　 strong 4、美国NHTSA-NCAP /strong /p p style=" text-align: center " strong img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 250px height: 142px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/2fb157dc-61b9-4a20-a969-bb2328bd6b66.jpg" title=" u=698911361,2565562998& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" alt=" u=698911361,2565562998& amp fm=173& amp app=25& amp f=JPEG.jpeg" width=" 250" height=" 142" border=" 0" vspace=" 0" / /strong /p p 　　这几家评级机构就像风景名胜一样各具各特色，各个机构都有别于其他机构的“特色”碰撞试验项目，这些项目我们称之为“镇家之宝”也不为过。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 碰撞测试最高时速只有64公里？ /strong /span /p p style=" text-align: left " 　　目前，无论是美国的IIHS，还是欧洲的E-NCAP，以及中国的C-NCAP，在汽车正面碰撞测试时，最高时速设定到40英里（64公里）。因为以现在汽车主流的安全技术，碰撞速度再提高，成绩就很难看了，比如碰撞时速提高到60英里（96公里）之后，再牛、再昂贵的“五星安全”量产车，成绩也会瞬间跌落到“无星”。现实中的致命车祸，多数是在比较低的车速下发生的。据美国NHTSA（道路交通安全管理局）的一个统计，在驾乘人员系安全带的情况下，美国发生的正面碰撞致命车祸，时速50公里以下的超过一半。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 329px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/c100a37e-7745-4b25-bd80-a84976e824af.jpg" title=" f31e9a6f65114a62bcecc8e4b60a06b0.jpeg" alt=" f31e9a6f65114a62bcecc8e4b60a06b0.jpeg" width=" 450" height=" 329" border=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　 /p p span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 　　碰撞时速超过64公里会怎样？ /strong /span /p p 　　德国的ADAC（全德汽车俱乐部）曾在2008年8月份做过一次对比测试。测试选用了两辆雷诺拉古娜三厢轿车，这款车在当时欧洲E-NCAP碰撞测试中获得最高等级评价。一辆灰色轿车以时速40英里（64公里）碰撞，另一辆橙色轿车以时速50英里（80公里）碰撞，结果是，时速仅提高了10英里（16公里），但后果要严重多了。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 324px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/1b0d77bd-035d-4efd-b582-cef76cd471bd.jpg" title=" 9ec203cdfdbc4346840c718dc91fcfe2.jpeg" alt=" 9ec203cdfdbc4346840c718dc91fcfe2.jpeg" width=" 450" height=" 324" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 时速80公里撞击之下（上图），A柱溃缩，车门明显变形 /p p 　　撞击后的灰色轿车，A柱没有明显变形，驾驶位车门可以正常打开，驾驶位的测试假人没有明显损伤。而时速提高到50英里（80公里）的橙色轿车，A柱明显溃缩，驾驶位车门变形后移，无法正常打开；尽管有安全带和气囊的约束，驾驶位的测试假人的胸部还是撞到了方向盘上，仪表台也明显后移，撞到了假人的腿部。这种情况下，驾驶者受伤严重到什么程度、能不能活着出来，很大程度上就看运气如何了。 /p p 　　 strong 据悉，玛莎拉蒂撞宝马事件当中，玛莎拉蒂当时时速超过120km/h，妥妥的死亡速度！ /strong /p p 　　因此，即便是安全等级再高的车型提高的只能是车辆本身的安全系数，减少的也只是理论上的人身伤害，并不会保证你安全无虞，而安全行车、改变对汽车安全的态度才是安全性的根本所在。 /p

流变和拉曼光谱的再次碰撞UV胶的固化流变学已成为UV固化动力学研究中较为常用的表征方法。流变学中的参数—动态弹性模量G'对形态结构极其敏感，能够很好的反映体系在辐射固化交联过程中双键密度和内部结构发生的变化，因此实时监测G'的变化可以从体系结构的角度反映固化程度。UV固化本质是一种化学反应，材料暴露在特定的UV辐射下会引发自由基反应，导致机械结构发生明显变化。因此UV固化还可以通过拉曼光谱进一步监测，这些化学变化将会通过特征峰的生成或降低（缓慢或快速变化）反映在拉曼光谱中。流变仪与拉曼光谱相结合，可以同时获得材料的化学结构和物理性质的信息，将这些信息关联起来以获得在材料加工、反应机理方面更加深入的洞悉。UV固化系统和拉曼光谱仪均可通过安东帕MCR系列流变仪软件进行触发，从而能够同步监测整个UV固化过程中的粘弹性力学行为和光谱数据。流变&拉曼联用Omnicure S1500紫外固化系统，配备5mm光纤。Cora5001拉曼光谱仪，配备特制的联用拉曼探头——HT fiber probe 785。MCR流变仪，使用帕尔贴罩（H-PTD）和25mm石英玻璃平板。UV固化系统和拉曼仪均连接至MCR流仪中，从而UV辐射源和拉曼光谱仪都可以通过流变仪进行自动触发，保障原位测量的同步性。独特接口设计UV源与特制的联用拉曼探头实验结果图1：UV胶固化反应过程中的损耗模量（红色）和储能模量（黑色）变化曲线流变测量的结果如图1所示。从测量结果可以看出，样品最初表现出粘弹性流体响应，其损耗模量（G'）大于储能模量（G'）。随后，在UV辐射下激发了固化反应，从而可以观察到模量的快速变化。两个模量的变化曲线的交叉点意味着样品从液体主导状态转变为固体主导状态。然而，在5s的UV辐射时间结束后，固化反应继续进行，这可以从模量的持续增加中观测到。图2：950cm-1和1150cm-1的峰强随固化时间的变化图2为两个拉曼特征峰（950 cm-1和1050 cm-1）的峰强变化曲线。所选的这两个特征峰具备一定代表性，因为大多数其他特征峰的行为与其中一个相似。在5s的UV辐射下，两个特征峰都出现了峰强的骤降。在UV辐射结束后，950 cm-1的峰强迅速达到稳定水平，标志着相应基团化学变化的结束；而1050 cm-1的峰强是逐渐下降的，这与之前图1所示的模量逐渐增大相呼应；其余特征峰强度的变化率都处于上述两个特征峰之间。拉曼光谱中的整体化学信号变化与流变性能变化趋势相吻合，两种技术可以相互印证。然而，拉曼光谱中展示的信息非常丰富，不同特征峰的强度变化曲线代表不同化学基团的反应特性，因此，可以获得每一个感兴趣的化学基团的变化信息。拉曼光谱的这一特性，不仅是样品整体流变特性的补充，还为深入了解不同反应基团的特性提供了可能性。实验结论安东帕的流变-拉曼联用设备已被证明对监测复杂的反应机理非常有益。MCR系列流变仪还可以与不同激发波长的Cora5001拉曼光谱仪，以及不同的UV固化系统（不同波长、汞灯、LED光源）相结合，且流变仪可使用多种型号（如珀耳帖或电加热），为各种应用提供最大的灵活性。想要了解完整的本次应用报告，请点击下载。