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DHG-9070A,上海一恒出产的电热恒温鼓风干燥箱,仪器说明书上说使用温度上限200度,有没有人在180度温度下连续使用3天啊?本人需要在180度的条件下连续3天使用用来合成催化剂。
Q1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT,获得游离的5'- OH;(2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基5'-OH仍然被DMT保护,3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应;(3) 封闭:耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应,用封闭试剂终止其后继续发生反应;(4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成后如何处理?切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。储存:分装抽干。Q3.需要什么级别的引物?根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增60 basePAGE诊断PCR扩增 40baseHEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆,点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE,HPLC基因构建(全基因合成)根据实验要求定HEPDPAGE反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC Q4.引物的质量是不是跟序列有关?四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者,国内公司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明,如果引物中有超过三个连续G的结构,传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍,对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d(G)都能得到同样的非常好的结果。Q5.需要合成多少OD数?根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。Q6.如何计算引物的浓度?引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul,称为保存浓度,而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积(微升)可直接参照合成报告单上推荐的体积,也可按下列方式计算:V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意:1 OD260= 33 ug/ml。Q7.如何计算引物的Tm值?引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为25base以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:Tm = 81.5 + 16.6 x Log10 + 0.41 (GC%) - 600/size**公式中,Size =引物长度。
1. waters aquilty UPLC-SQD,之前都正常2. 前几天打过一针合成的物质(可能含盐),用甲醇配成1.5ppm浓度,过滤后进样,信号高达10的9次。且点任何地方,出来都是m/z 242。打下一针样品,出来也是242,但还是连续的色谱图。系统已污染。3. 因引起污染的样品溶于甲醇,以为是强保留物质,就用甲醇在小长假间小流量冲洗了3天(怕停电,质谱关掉)。因担心含盐,又用水冲洗了4小时。4.今天进样,发现打空白样基线不连续,有些时段TIC为0,打标曲,没有目标峰(成熟的方法)。5. 该仪器流动相基本为乙腈和纯水。观察喷雾状态,是连续喷雾的。SQD没提示错误,参数也都能达到设置状态。用的ESI+, scan模式6. 洗过一级锥孔未解决,重启软件、电脑、SQD,均未解决。7.仪器的Masslynx console界面最近一直显示local,在被污染前就这样。是否软件有问题,造成通信出错?还是硬件的某部件堵了?有遇到类似情况吗,如何解决呢