候选放射抗性基因

土壤是抗生素抗性基因（ARGs）的重要储库，土壤中的ARGs可通过食物链等途径威胁人类健康。相较于越来越多的关于营养物质、金属和抗生素等人为排放物质扰动抗生素抗性基因的报道，关于土壤抗生素耐药性的自然演替规律过程却知之甚少。该论文基于海伦农业生态实验站长期定位实验，在时空均质且人类活动影响较小的三种土地利用类型（耕地、草地和裸地）上，探究土壤抗生素耐药性的自然演变和分化。研究发现，土壤有机碳、氮素、土壤微生物量、生物有效态重金属含量以及抗生素耐药性 (包括多样性和丰度)均呈现出草地、农田、裸地依次递减的趋势。此外，研究发现有69种ARGs和14种可移动遗传因子（MGEs）在三种土地利用土壤中共享。多种因素(如土壤性质、重金属、细菌群落和MGEs)共同促进了抗生素耐药组的演变，其主导驱动力主要为MGEs的直接和间接作用。研究结果表明，减少土壤中ARGs的途径可能与土地退化过程相吻合，这对可持续管理环境的共同目标构成了挑战。以上研究结果作为补充封面文章发表在Environmental Science& Technology期刊，中国科学院南京土壤研究所特别研究助理付玉豪和硕士毕业生胡芳为论文共同第一作者，中国科学院南京土壤研究所研究员王芳和中国科学院东北地理与农业生态研究所韩晓增研究员为论文共同通讯作者。研究工作得到国家自然科学基金等资助。基于30年土地利用变化揭示土壤抗生素抗性基因的自然演替规律

新污染物治理列为全面推进美丽中国建设的重要内容，是当前生态环境工作新热点。新污染物种类繁多、性质各异，且在环境中存在的浓度往往极低，这要求检测技术必须具备更高的灵敏度、准确性和选择性。近年来，随着科技的快速发展，新污染物的分析检测技术取得了显著进步。为了更好的展现新污染物分析检测技术的创新成果，以及了解目前行业发展的现状，仪器信息网特别策划《环境新污染物分析检测技术与行业进展》主题约稿活动，集中展示新污染物检测领域的最新成果，以下为同济大学张国晟老师回稿。南方某市水源水胞内、胞外抗性基因分布研究张国晟1,2，谷纪元1,2（1.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092；2.长江水环境教育部重点实验室，上海 200092）作者邮箱：zhanggs371@163.com1 引言抗生素被广泛用于治疗细菌感染等疾病，但抗生素的滥用促进了抗生素耐药性细菌（antibiotic resistant bacteria, ARB）和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的增殖与传播[1]，目前使用的大多抗生素都可以在环境中找到对应的ARB[2]。中国是抗生素耐药性发生率最高的国家之一[3]。ARGs是编码抗生素耐药性，是环境中广泛存在的一种新污染物，具有迁移转化途径复杂和种类多样等特点，对人类健康存在威胁，成为世界各地面临的日益严峻的挑战[4]。ARGs可分为胞内抗生素抗性基因（intracellular antibiotic resistance genes，iARGs）和胞外抗生素抗性基因（extracellular antibiotic resistance genes，eARGs）。iARGs被认为是自然环境中ARGs的主要部分，而eARGs在水环境中占主导地位[5]。由于河流系统中复杂的水质状况（抗生素、重金属、有机污染物等）形成的选择压力，与其他环境相比，河流系统有更多的机会实现ARGs的转移与运输[5]。因此，本研究针对南方某河流开展调研，定量分析该河流中iARGs与eARGs的分布差异。2 实验材料和方法研究对象为南方某市给水厂水源水，采样时间为2024年1月。当场测定部分常规理化指标后，采集5 L样本并立即运送至实验室进行后续处理。iARGs与eARGs分别按下述方法提取：5 L水样在负压抽滤下通过0.22 μm滤膜并收集滤后水。将滤膜浸泡在100 mL 含3%牛肉膏的溶液中，磁力搅拌30 min洗脱细菌。洗脱液以10000 g离心10 min，丢弃上清液。向沉淀中加入PBS使其重悬，用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP712）提取DNA后，即得含iARGs的待测液。向滤后水中加入pBR322质粒作为内参（终浓度约103 copiesL&minus 1），以50 mLmin&minus 1的流速通过装有核酸吸附颗粒（制备方法见参考文献[6]）的滤柱，用100 mL洗脱液（15 gL&minus 1氯化钠、30 gL&minus 1胰蛋白胨、15 gL&minus 1牛肉膏、3.75 gL&minus 1甘氨酸，pH=9.3±0.2）洗脱，洗脱液通过0.22 μm过滤器后，加入等量异丙醇，室温静置16 h；再以13000 g离心10 min，弃去上清液，用70%乙醇重悬沉淀并重新以13000 g离心5 min；弃去上清液后，静置数分钟待乙醇充分挥发后，再加入1 mL TE缓冲液，即得含eARGs的待测液。利用荧光定量PCR技术(qPCR)检测9种代表性的ARGs与1种用于介导ARGs传播的I型整合子，引物及ARGs靶向目标详见表1，所用仪器为ABI7500，反应试剂为TB Green® Premix Ex TaqTM II（Takara公司），终体系20μL。表1 本研究所用引物ARGs种类序列(5’→3’)靶向目标16S rRNAF:CGGTGAATACGTTCYCGGR:GGWTACCTTGTTACGACTTtetAF:GCTACATCCTGCTTGCCTTCR:CATAGATCGCCGTGAAGAGG四环素类tetCF:GCGGGATATCGTCCATTCCGR:GCGTAGAGGATCCACAGGACG四环素类续表ARGs种类序列(5’→3’)靶向目标sul1F:CACCGGAAACATCGCTGCAR:AAGTTCCGCCGCAAGGCT磺胺类sul2F:TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGGR:CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG磺胺类aadAF:GTTGTGCACGACGACATCATTR:GGCTCGAAGATACCTGCAAGAA氨基糖苷类rpoB1F:GGTCGCCGCGATCAAGGAGTR:GTGCACGTCGCGGACCTCCA利福平类katGF:GAAACAGCGGCGCTGATCGTR:GTTGTCCCATTTCGTCGGGG利福平类dfrA1(1)F:GGAATGGCCCTGATATTCCAR:AGTCTTGCGTCCAACCAACAG甲氧苄啶类blaIMPF: GGCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCR: CGTACGGTTTAACAAAACAACCACC碳青霉烯类pBR322F:TTACCCCCATGAACAGAAATCCR:ATGTTAAGGGCGGTTTTTTCC内参基因intI1F: CCTCCCGCACGATGATCR: TCCACGCATCGTCAGGCI型整合子3 实验结果和讨论常规理化指标检测结果见表2，根据该市公布的检测结果，该水源为II类水体。表2 常规理化指标温度/℃pH浊度/NTU游离氯/mgL&minus 1总氯/mgL&minus 1电导率/μScm&minus 117.28.493.60.080.13319ARGs检测结果如图1所示，iARGs以相对丰度（iARGs与16s rRNA的绝对丰度之比）表示，eARGs以绝对丰度表示。在iARGs中，9种待测ARGs均被检出。除常见的四环素类抗性基因(tetA、tetC)和磺胺类抗性基因(sul1、sul2)等被检出外，临床上用于治疗严重细菌感染的碳青霉烯类抗性基因blaIMP也被检出。其中blaIMP相对丰度最低，为1.03×10&minus 6；其他ARGs的相对丰度变化较小，均约10&minus 4~10&minus 2。在提取到的iDNA中，I型整合子的相对丰度为10&minus 6，表明在不同细菌之间存在一定频率的ARGs迁移与转化。在eARGs中，除blaIMP未检出外其余8中ARGs均有检出，不同种类ARGs的丰度变化较大：sul2的丰度最高，为1.11×108 copiesL&minus 1；katG的丰度最低，为1.69×105 copiesL&minus 1。在提取到的eDNA中，I型整合子的丰度为1.36×106 copiesL&minus 1，表明在该河流的不同细菌群落之间，同样存在一定频率的ARGs迁移与转化。图1 南方某河流iARGs和eARGs丰度4 结论与展望水源水中存在的ARGs污染，除了来自上游污水厂的排放外，还可能来自沿途雨水的汇入[7]。此外，河流中存在的抗生素污染也会促进细菌产生抗生素耐药性，进而导致产生ARGs污染。已有研究表明，饮用水中存在的eARGs可影响小鼠肠道菌群并诱发肠道炎症[8]。而饮用水厂通常并不能实现ARGs的有效去除，甚至可能促进ARGs的富集[9]。因此，水环境ARGs污染所带来的健康风险应当引起重视，进行水体ARGs相关检测同样必要。这也对未来我国提高饮用水标准、改进自来水厂工艺措施以提高ARGs去除效果带来了新的挑战。参考文献[1] Holm R, Sö derhä ll K, Sö derhä ll I. Accumulation of antibiotics and antibiotic resistant genes in freshwater crayfish–effects of antibiotics as a pollutant[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2023, 138, doi:10.1016/j.fsi.2023.108836.[2] Zhang T Q, Lv K Y, Lu Q X, et al. Removal of antibiotic-resistant genes during drinking water treatment: a review[J]. Journal of Environmental Sciences, 2021, 104(6): 415-429.[3] Zhao H Y, Zhang M, Bian J, et al. Antibiotic prescriptions among China ambulatory care visits of pregnant women: a nationwide cross-sectional study[J]. Antibiotics, 2021, 10(601), doi:10.3390/antibiotics10050601.[4] Hao H, Shi D Y, Yang D, et al. Profiling of intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in tap water[J]. Journal of Hazardous Materials, 2019, 365: 340-345.[5] Yu W C, Xu Y, Wang Y W, et al. An extensive assessment of seasonal rainfall on intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in urban river systems[J]. 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细菌全基因组测序的最新进展让研究人员成功绘制出了结核分枝杆菌抗生素耐药基因组特征的完整目录。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“Genomic signatures of pre-resistance in Mycobacterium tuberculosis”的研究报告中，来自帝国理工学院等机构的科学家们通过研究首次发现了细菌中“预抗性”（pre-resistance）存在的迹象，相关研究结果或能帮助临床医生未来选择针对细菌性感染的最佳疗法。图片来源：Unsplash/CC0 Public Domain文章中，研究人员对3000多份结核病样本进行全基因组测序，并在近20年里来追踪患者的结核病感染情况；结核分枝杆菌（MTB）是一种影响肺部功能的细菌性感染性疾病，2020年在传染病引发的死亡病例中其所引发的死亡仅次于COVID-19；如果使用正确的抗生素进行治疗的话，结核病患者就能被治愈，但治疗的时间很长，而且很多患者会面临无法获得足够医疗保健的风险，如果患者无法完成整个治疗过程，或者没有药物以及药物质量较差的话，就会出现耐药性结核病的发生。多重耐药性的结核病是一种巨大且不可持续的人类疾病负担，如今研究人员在少数国家已经发现了完全耐药的菌株，由于卫生系统正在努力应对当前新冠疫情，全球结核病治疗的进展已经大大放缓了。为了能够更好地理解并最终开发治疗结核病的新型疗法，这篇研究报告中，研究人员首次揭示了如何在耐药性突变发生之前预防结核病患者所出现的耐药性，研究人员将这一概念称之为“预抗性”，即当诸如病毒或细菌等致病微生物在未来产生耐药性的内在风险更大时。通过分析数以千计的细菌基因组，研究人员表示，这或许有望应用于其它传染性疾病的研究，并能为个体化的病原体基因组疗法铺平道路，研究人员会根据诱发疾病的特定病原体中的DNA来选择药物以免病原体产生一定的耐药性。文章中，研究人员比较了来自3135个不同样本中的结核病样本，以此来重建TB细菌家族族谱，其被称之为系统发育数，随后研究者利用计算机分析来识别出细菌的祖先遗传代码（随后会导致细菌产生耐药性），研究人员通过分析家族树的分支确定了与MTB耐药性发生相关的关键改变，从而就能理解哪些因素最有可能让MTB产生耐药性。图片来源：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27616-7研究人员描述了TB基因组中的突变如何帮助预测一种可能会产生药物耐受性的特定分支，然后他们在一个独立的全球TB数据库中验证了他们的发现。Grandjean博士说道，目前应对超级耐药细菌时我们在抗生素上的选择越来越少，而我们进行的选择往往具有一定的毒副作用，因此我们就应该另辟蹊径寻找能有效预防TB耐药性的策略。这行研究就是首个阐明我们能够领先药物耐受性产生的案例，这或许就能让研究人员未来利用病原体的基因组选择最佳的治疗性手段。研究人员希望本文研究能提供一种策略，通过靶向作用最有可能在未来产生药物耐受性的特定病原体基因组来治疗人类难以应对的疾病。综上，本文中研究人员描述了与耐药性获得风险较高的未点化额基因组多态性；同时研究人员还识别出了未来抗生素耐药性产生的标志物，其或能帮助开发新型靶向性疗法来预防结核分枝杆菌和其它病原体抗生素耐药性的产生。原始出处：Torres Ortiz, A., Coronel, J., Vidal, J.R. et al. Genomic signatures of pre-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Nat Commun 12, 7312 (2021). doi：10.1038/s41467-021-27616-7