代谢组学系统研究

p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 微流控芯片(亦称芯片实验室)技术是指在方寸大小的微芯片上加工微通道网络，通过对通道内微流体的操纵和控制，实现化学和生物实验室的功能。自上世纪90年代兴起以来，微流控芯片技术研究取得了快速发展，被列为21世纪最为重要的前沿技术之一，被认为有可能为生命科学的基础和应用研究带来颠覆性改变。近年来，微流控芯片技术不断引来相关领域学者的关注，有业内专家认为，微流控应用的春天来了。那么，微流控技术发展即将进入全新阶段了吗?带着这些问题，仪器信息网特别专访了浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授，请这位在微流控领域深耕二十余年的学者谈谈他对微流控技术发展的看法以及他们团队的最新研究成果。 /span /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 479px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202005/uepic/e60630bf-b260-4574-8ba2-1323ebdeda60.jpg" title=" 方群教授.jpg" alt=" 方群教授.jpg" width=" 600" height=" 479" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center " 　　方群教授 浙江大学微分析系统研究所 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 span style=" background-color: rgb(251, 213, 181) " strong 缘起：20年微流控科研旅程 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　很幸运，微流控技术起源于分析化学。1990年，瑞士有一位叫Manz的分析化学家在“Sensors and Actuators B: Chemical”创刊期发表了一篇概念性的文章，提出了“微全分析系统”(Miniaturized total analysis systems, μTAS)的概念。“他当时的想法就是在一个微加工的芯片上加工很多微通道的网络结构，在这些微结构中进行取样、样品前处理、分离、检测等所有步骤，将所有操作过程都集成到芯片上进行”方群教授向仪器信息网介绍道。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　1992年，Manz与加拿大的Harrison合作，共同研发设计了一款具有十字通道构型的玻璃芯片，并基于此实现了氨基酸的高速毛细管电泳分离。这个时候微全分析系统的概念才真正落地。后来人们查找早期的文献，发现在1979年美国斯坦福大学的Terry等人曾在“IEEE Transactions on Electron Devices”上报道过在硅片上集成加工微型气相色谱空气分析仪，但当时这个工作没有引起很大反响。反而是基于微全分析系统的概念，发展出了现在广为人知的微流控芯片技术。目前，微流控芯片可以简单定义为在加工有微通道网络的微芯片上，通过对通道内的微流体进行操控，完成化学或生物实验室的功能。由此可见，微流控芯片技术起源于分析化学技术与微机电系统(Microelectromechanical systems, MEMS)技术的结合，具有鲜明的学科交叉特色，已广泛应用于化学、生物学、医学、药学、材料科学、食品科学、环境科学等领域。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　90年代中期，国内学者敏锐捕捉到了这一研究动向，并紧追国际前沿。方肇伦院士是国内第一批从事微流控技术研究的学者。早在1995年以前，方肇伦院士就开始关注微全分析系统研究方向。1996年，他在中科院沈阳应用生态研究所的研究组开始尝试进行微流控芯片毛细管电泳的实验，同年他调入东北大学化学系组建分析科学中心，正式开展微流控芯片研究。2000年，方肇伦院士在浙江大学成立了微分析系统研究所，专注做微流控分析技术的研究。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　1998年，方群教授博士毕业后，曾在东北大学分析科学中心实验室从事了半年微流控毛细管电泳技术的研究工作。1999年，方群教授从香港浸会大学回到浙江大学加入微分析系统研究所，继续开展微流控技术的研究至今。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 span style=" background-color: rgb(251, 213, 181) " strong 切入：试样引入到多相微流控 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　国外已有先行者，国内研究尚未起步。在没有底子的情况下，是去模仿国外同行，还是围绕难点自主研发?模仿只能追赶，自主研发却有可能超越。“因为当时国际上已有先行者，而做基础研究需要有原创性，所以我们放弃了模仿的想法。”方群教授回忆说。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　据方群教授回忆，当年在选择研究方向时，有一个问题引起了他的注意：在做多个样品高通量筛选或者高速分析的时候，缺乏能够不断引入不同样品的方法。彼时，这个问题并不为大多数学者所关注，但无疑解决这个问题是很有价值的。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　经过慎重考虑，方群教授最终选择以“试样引入”作为发力点切入微流控领域，并正式开始微流控技术的研究。在建所两年时，他们的研究成果首次在国际分析化学领域的权威期刊“Analytical Chemistry”上发表，这也是我国学者发表在该期刊上的第一篇关于微流控芯片技术的文章。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“最初，我的预想是在几年内就全部‘吃透’试样引入这个研究方向，然后就可以换方向做点别的。但随着研究组对试样引入研究的加深，逐渐发现这个方向很重要，有很多问题需要解决，在解决这些问题过程中，我们对微流控技术的理解也越来越深入。这个方向就一直做下来了，如今已经成为研究组开展各种拓展工作的基石。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　近十年，方群教授主要从事多相微流控技术研究，该技术是微流控分析领域的新一代前沿技术之一。何为多相微流控?这其实是针对“单相”来说的。多相微流控学，是利用多相微流体的物理化学特性和尺度效应，在微通道或者微结构中进行多相微功能单元(如微液滴、微颗粒、微气泡等)的生成、操控、反应、分析、筛选等操作的技术和科学。方群教授介绍说：“简单来说，单相是指在微通道里面只有互溶的水溶液。现在大家研究比较多的‘油包水’的液滴其实就是多相体系的一种，又叫液滴微流控系统”。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" background-color: rgb(251, 213, 181) " strong 顿悟：蓦然回首，那人却在灯火阑珊处 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“控”是微流控技术的精髓与核心。“要让微流体听你的话，就要通过各种“控”的方法去精准地操纵它们来完成实验室的各项工作。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　目前，微流控芯片研究比较注重芯片的专用化，所采用的微流体操控方法也是多种多样。但如果过分强调芯片系统的专用化，一方面会使微流控芯片品类繁多，导致使用人员不便选择与使用。另一方面会造成整体微流控系统难以集成，实验操作复杂。那么，如何以相对少的硬件系统，适应更多不同的应用场景呢? /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　这个问题一直萦绕在方群教授脑海中。他的研究组也一直在尝试不同的路径和方法，试图找到这么一个通用又灵活的微流控技术。方群教授终于找到了，但他没想到的是，这项技术竟源自当时团队正在进行的基于微流控液滴的高通量筛选工作。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　当时，研究组正在搭建基于毛细管探针和液滴阵列的自动化高通量筛选平台，在平台的应用过程中越来越显示出其独特的优势和应用潜力，蓦然发现“没想到辛苦找寻已久的技术竟然就在自己身边。”方群教授兴致勃勃讲到：“经过一番提炼和改造，这套技术就成型了!” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　方群教授给这套技术命名为序控液滴阵列技术(Sequential Operation Droplet Array)，英文简称SODA。他表示，之所以起这个名字，一是为了致敬给自己确立研发目标带来灵感的顺序注射分析(Sequential Injection Analysis)技术，二是因为这个名字谐音英文“苏打水”，好记易推广。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 586px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202005/uepic/469e1d34-27b6-4b93-8298-40e9d7c35333.jpg" title=" 第三代SODA仪器（可分享图片）.png" alt=" 第三代SODA仪器（可分享图片）.png" width=" 500" height=" 586" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center " 　　第三代SODA仪器 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong span style=" background-color: rgb(251, 213, 181) " 利器：看好SODA这三大应用场景 /span /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　灵活操控微量流体是SODA系统最为突出的优点。SODA系统能够通过吸-点-移三个单元操作的灵活组合，在皮升精度水平自动化地完成多步复杂的液滴操控，包括液滴生成、转移、融合、分裂、寻址、分选等。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　极佳的系统通用性和兼容性是SODA系统的另一大优势。目前，SODA系统已应用于单分子/单细胞分析、高通量筛选、微量细胞实验、微量样品分析、现场分析等多个领域。此外，SODA系统的半开放特性使其能够方便地与液相色谱、毛细管电泳和质谱设备兼容使用。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“随着我们对SODA技术的研究不断深入下去，越发觉得这套系统功能强大，能够完成很多任务，尤其适合在超微量样品和试剂消耗下开展多种类、大规模的分析和筛选，以及进行复杂、多步骤的微量样品处理和分析，因此非常值得大力推广。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“SODA可以提供一种不同于现有微流控技术的微流体操控技术，有望为化学、生物、医学、药学等领域的基础与应用研究提供重要的平台工具。”方群教授介绍说。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“我们很想把SODA做成一套成熟的系统化的装置，然后从众多应用中选择若干突破口，真正实现SODA仪器的产品化。这是我们目前的一个重点研发方向。”方群教授表示，在众多SODA的应用中，他尤其看好单细胞分析、高通量筛选和家庭实验室这三大应用。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 单细胞分析 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　微流控学是在微米级结构中操控流体的技术和科学，而细胞的粒径在数微米到数十微米之间，所以微流控系统天生适合做单细胞操纵和分析，SODA系统也不例外。单细胞研究对于目前生物医学的基础研究和临床诊疗意义重大。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　2014年，方群教授与国家蛋白质科学中心的黄超兰研究员合作，共同进行单细胞蛋白质组的研究。“我们利用SODA系统进行超微量单细胞样品的复杂预处理和进样，在纳升级水平完成了单细胞的微液滴包裹、细胞膜破碎、细胞蛋白质释放、蛋白质还原和烷基化、两步酶解、毛细管色谱柱进样，再配合后续的色谱分离和质谱检测，实现了在单细胞水平上的蛋白质分析和鉴定。2018年这个研究成果发表在Analytical Chemistry(2018, 90, 5430)上。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　与现有方法相比，SODA在降低单细胞样品预处理过程中的损失方面具有明显优势，这个结果也给了我们很大信心，它有可能解决单细胞样品预处理方面长期存在的瓶颈问题，也有可能将多种单细胞操作集成进行，如单细胞分选、液滴包裹、培养、刺激、多组学(如基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等)分析等。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 高通量筛选 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　传统的高通量筛选系统样品和试剂的消耗通常在微升级。多数的微流控液滴系统适合生成大量的来自于单一样品的液滴，当需要生成大量不同样品来源的微液滴时，上述的液滴生成方式则行不通。针对这个问题，方群教授研究组基于SODA技术，研制了多款应用于分子/细胞水平药物筛选和蛋白质结晶筛选的高通量筛选平台。在针对大规模样品的高通量筛选中，其试样/试剂消耗较文献报道的系统及商品化仪器有明显优势。此外，在已经完成了基于单根探针的SODA系统基础上，他们正在加快研发基于12根探针的超高通量SODA系统以实现超高通量筛选的目的。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 家庭实验室 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　在讲到家庭实验室(Lab at Home)想法时，方群教授以计算机的发展做了类比。计算机的发展经历了巨型化、台式机化、笔记本电脑化、网络化和智能手机化等发展阶段，如今深刻影响着每个人的生活。方群教授表示，分析仪器也可以像计算机一样，最终进入寻常百姓家。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“我们研究微流控的最终目的是要让微流控分析产品走近老百姓，走进千家万户，就像手机一样普及到每个家庭。这个概念类似于POCT(现场检测)，但又与POCT有所不同。家庭检测设备对仪器的自动化、集成化和通用性有很高的要求，此外还要求仪器和检测的成本要比较低。但对仪器的微型化和便携化要求则比POCT要低。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“如果能将生物和化学分析仪器普及到每个家庭，那么每个家庭都将成为大数据的一个产生源点，将这些数据汇集，将会给大数据、物联网或者人工智能提供非常丰富的生物和化学数据支撑，而这是目前非常缺乏的。”谈到这里时方群教授非常激动，他表示：“做这个很难，但长期看这是一定要做的。总得有人做，总得有人开始去做。而SODA技术就其特点来说，很有可能为此做出贡献，所以我们现在非常想去推进。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“我们希望达到的目标是，吸取一滴血，就可以进行生化、核酸、免疫和细胞等多类指标的检测。”“其实这里面有许多难题，一滴血体积很小，只有30-50微升，另外血液很粘稠且成分复杂，对其进行定量量取和精准操控很有难度。” /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　目前，方群教授团队已经完成一款基于SODA技术，并且适用于家庭实验室场景的自动化核酸分析原理样机。该仪器可以自动化进行样本的核酸提取、逆转录和实时PCR定量分析，完成一个样品中6个流感指标的检测，且成本较市售类似产品大幅降低。最近，他们还实现了针对一滴血样品的自动化血浆分离与定量稀释，以及后续的血糖和胆固醇分析。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“从目前来看，SODA技术在进行微量样品的多步复杂操作方面很有优势，我们也很有信心。”方群教授表示，希望与有情怀、有眼光和有能力的厂商合作，共同实现仪器的产业化，供大家使用。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " 　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 　 strong 后记 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 　　微流控领域已经发展了30年，最近该领域又频现新的突破。有专家评论，微流控的春天来了。方群教授深以为然，“我确实深有同感，非常同意这句话。” /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 　　方群教授团队在微流控分析仪器研制方面，成果非常丰富。已研制的仪器有单细胞分析平台、高通量筛选平台、自动化核酸分析仪、高速毛细管电泳分析仪、手持式激光诱导荧光检测器、小型流式细胞仪等，目前均已供实验室内部使用，部分还提供给相关合作单位使用。 /span /p

帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）是由基因、环境和家族因素相互作用引起的神经退行性疾病。值得注意的是免疫系统对疾病发展的影响，脑部驻留的小胶质细胞的功能障碍，会导致神经元的丧失和症状加剧。研究人员通过神经免疫系统模型来更深入地了解这些神经退行性疾病的生理和生物学方面以及它们的发展过程。不列颠哥伦比亚大学的Stephanie M. Willerth教授团队和英国诺丁汉特伦特大学的Yvonne Reinwald教授团队于2024 年 1 月 23 日在《Journal of Neuroinflammation》（影响因子：9.3）杂志上发表了题为“Modeling the neuroimmune system in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases”的综述，介绍了神经免疫系统在三维模型和器官芯片系统方面取得的进展，以及模型在准确模拟复杂的体内环境方面的巨大潜力。 研究背景阿尔茨海默病（AD）是老年人中最常见的痴呆类型，与淀粉样斑块和磷酸化Tau蛋白的异常积累有关，虽具体原因尚不完全清楚，但与遗传和环境因素相关，诊断及早干预至关重要。帕金森病（PD）是一种神经系统疾病，主要表现为运动障碍，与聚集的α-突触核蛋白（α-syn）沉积物Lewy小体有关，相关基因变体也与其发病风险增加有关。尽管PD的确切原因尚不清楚，但其发病机制可能涉及多巴胺能神经元功能障碍以及氧化应激、线粒体功能受损、蛋白质代谢异常和神经炎症等多种因素。图1：阿尔茨海默病和帕金森病的病理生理学。 中枢神经系统（CNS）过度炎症的特征包括多种因素共同促进疾病进展，其中包括各种抗炎与促炎细胞因子的失调、CNS内小胶质细胞等免疫细胞的表型转化，以及外周细胞的巨噬细胞和淋巴细胞的招募，这些因素均导致突触丧失，成为随后认知功能障碍的最常见病理相关因素。图2：健康与病理神经免疫系统的比较:在健康的神经免疫系统中(1)小胶质细胞处于稳态和监视状态，(2)外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润有限。在病理性神经免疫系统中：(3)小胶质细胞反应性增强，形态改变，(4)吞噬作用增加，(5)炎症标志物增加，(6)外周免疫细胞浸润增加。 研究进展1、目前阿尔茨海默病和帕金森病的治疗和临床试验针对AD，乙酰胆碱酯酶是一个常见的药物靶点，近期研究专注于开发单克隆抗体等药物以减少Aβ负荷，如lecanemab和aducanumab。此外，针对AD的临床试验正在进行中，旨在测试药物、设备和行为以改善患者认知和减缓疾病进展，而对于PD，则主要以药物和深部脑刺激为主要治疗手段，同时也在研究新的免疫调节治疗方法。 2、阿尔茨海默病、帕金森病和免疫系统的体外免疫系统模型癌症免疫系统的研究已经取得了许多成果，其中包括对3D模型的发展，这对于疾病建模和药物筛选至关重要，尤其是针对新的化疗药物和人工组织的开发。一种体外建模方案是使用细胞系，最常用的是SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系，模拟未成熟的儿茶酚胺能神经元，并可通过暴露于神经毒素或基因修饰来模拟AD或PD。然而，SH-SY5Y存在缺乏确立的培养维持程序、实验结果不一致和细胞生长的可变性等缺点，且不表现出成熟神经元的电生理和电化学特征。利用诱导多能干细胞（iPSC）创建基因准确的AD和PD模型，成为一个快速发展的研究领域，这些模型可以通过体细胞来源的iPSC诱导后，生成神经元与免疫细胞，用来构建AD和PD模型。图3：神经免疫系统的体内和体外模型的优缺点。 3、器官芯片模型在神经免疫系统研究中的新进展器官芯片平台的出现为建立体外模型提供了增强的设计和控制能力，能够模拟生物、生化、生理和机械现象，在活体器官系统中的发生。从血液-脑脊液屏障微流控模型到脑芯片模型，研究者们不断探索着复杂的生理学建模，为深入分析神经免疫相互作用提供了新的可能。这些模型不仅揭示了神经炎症在神经退行性疾病中的重要性，还为治疗干预提供了潜在途径，为了解AD和PD的潜在机制提供了宝贵的见解。同时，脑芯片模型被广泛应用于研究神经血管相互作用和神经退行性的不同方面。通过模拟神经-胶质-血管相互作用，研究人员发现了柴油排放颗粒等外源因素对AD类疾病病理特征的影响。这些研究不仅强调了神经免疫特异性行为的重要性，还突显了人类细胞模型在理解神经退行性疾病方面的关键作用。然而，尽管研究对细胞间相互作用和人类细胞模型的依赖日益增加，但对于AD和PD潜在机制的理解仍然相对有限。图4：芯片上器官的发展:示意图显示了开发和制造微流控芯片所需的步骤 先进的免疫细胞相互作用在AD和PD病理中至关重要，调节其功能可能为更有效的治疗提供希望；器官芯片模型具有模拟复杂细胞相互作用的优势，有助于深入了解AD和PD疾病机制并发现新的治疗策略。 文献索引：Balestri W, Sharma R, da Silva VA, Bobotis BC, Curle AJ, Kothakota V, Kalantarnia F, Hangad MV, Hoorfar M, Jones JL, Tremblay MÈ , El-Jawhari JJ, Willerth SM, Reinwald Y. Modeling the neuroimmune system in Alzheimer's and Parkinson's diseases. J Neuroinflammation. 2024 Jan 23 21(1):32. doi: 10.1186/s12974-024-03024-8. PMID: 38263227 PMCID: PMC10807115. 关于艾玮得生物作为一家专注于人体器官芯片及生命科学设备研发与生产的创新科技公司，艾玮得器官芯片应用全场景解决方案已能够全面覆盖新药研发评价、临床药敏检测、基础科学研究等应用领域，为科研、临床、药企等客户提供一站式解决方案。

细胞异质性作为细胞系统中一种普遍存在的现象，受到生物研究领域的日益关注。在传统的群体分析中，单个细胞的独特差异往往被整体的平均值所掩盖，而这些被忽略的细节恰恰构成了细胞分化过程中的关键线索。随着微阵列芯片、核酸测序、质谱等技术的进步，对单一细胞进行基因组、转录组、代谢组和蛋白组分析已不再遥不可及。特别是核酸扩增技术的进步极大地推动了基因组、转录组在单细胞层面的测序技术的应用。尽管取得了这些进步，但在单细胞层面对蛋白质和代谢物的分析仍然面临重大挑战，这主要是由于它们的量有限且缺少有效的扩增手段。本文提出了一种新的策略，通过一次性单细胞蛋白质组和代谢组分析（scPMA），可以在单次LC-MS/MS分析中同时获取单个细胞的蛋白质和代谢物信息。通过这种策略，研究人员能够整合单个细胞的多组学数据，以深入理解细胞内部相互作用的网络和调控细胞状态的复杂机制。scPMA策略共包括以下三个部分（图1）：单细胞捕获及分离、纳升级样品预处理、一次性LC注入和质谱检测。前两个环节都是基于课题组前期自制的机械装置操作完成的，最后一部分才是scPMA策略的亮点。在常规分析流程中，由于蛋白质组和代谢组在物理化学特性上的根本差异，它们通常需要匹配不同的质谱检测技术。因此，在传统的样本预处理阶段，蛋白质和代谢物会被分离，随后各自经历特定的处理流程，并最终分别进行LC-MS/MS检测。然而，这些额外的分离和处理步骤不仅增加了分析的复杂性，而且往往不可避免地会导致样本的损失，特别是在处理单细胞水平的微量样本时，这种损失尤为显著，可能对研究结果的准确性和可靠性造成影响。基于此，作者希望能够开发一种易于使用的方法来实现同一单细胞个体的蛋白质组和代谢组同步分析。图1 一次性单细胞蛋白质组和代谢组同步分析示意图实际上，代谢物和蛋白酶切后的肽段在C18反相色谱柱上的保留时间是存在差异的。如图2所示，在作者设置的45 min梯度下，大部分A549细胞酶切的肽段在9至17 min的范围内就已流出（图2a），而此时流动相中乙腈的最高含量仅为40%。而A549细胞产生的代谢物则主要分布在17 min之后，只有极少部分是在17 min以前流出（＜10）（图2b）。导致这些现象的根本原因是肽段与代谢物之间疏水性的差异，因此，该策略更适合蛋白组与有一定疏水性的代谢物分析。得益于C18的有效分离，可以在色谱梯度的不同时间段针对不同的样本成分（肽段/代谢物）设置不同的质谱检测参数（图2c）。有效的色谱分离加与之匹配的双区域质谱检测便可实现一次性单细胞蛋白质组和代谢组双重分析。与之前的单组学的结果相比，scPMA策略在定量深度上并无明显差异（图2d-f）。图2 单蛋白质组和代谢组分析与scPMA的性能比较 通过scPMA策略，研究者们能够对单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）进行双重组学分析，平均定量了816、578和293个蛋白质以及72、91和148个代谢物。并利用UMAP聚类和随机森林机器学习模型，基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息，实现了对细胞类型的初步分类（图3、4）。根据结果可得知，细胞在代谢组中的异质性要大于蛋白组。图3 scPMA策略分析单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）图4 基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息对细胞进行分类随后，作者还利用scPMA方法在单细胞水平上研究了多柔比星对肿瘤细胞的诱导作用（图5）。对比药物处理组的各个单细胞样本发现给药后不同的单细胞在蛋白质表达上存在着异质性，这也是在群体分析中无法观察到的现象。与未给药的细胞相比，给药组共鉴定出255个差异蛋白(图5b、c)，一些肺癌细胞中过表达的蛋白显著降低。大部分的差异蛋白涉及的通路与DNA、染色质、核小体的合成有关（图5g）。同样，给药组和未给药组中鉴定出的代谢物也被用于UMAP聚类(图5d)和差异分析。差异分析结果(图5e、f)显示，93种代谢物有差异表达。其中，多柔比星仅在给药组检测到。值得注意的是，在给药组的各个细胞中，多柔比星丰度有明显的离散分布，甚至有10倍的丰度差异。这一结果表明不同的细胞个体具有不同的药物吸收水平，从而表现出明显的细胞异质性，这可能为进一步深入探索提供启发。基于差异蛋白质组和代谢组信息，利用MetaboAnalyst 5.0进行联合通路分析，分别富集出62条和234条相关通路。其中有37条显著相关的通路涉及的差异蛋白和代谢物与核糖体、DNA复制等药物作用机制有关（图5i）。图7.氘代差异分析流程示意图这些结果展示了scPMA策略在单细胞分析中的潜力，尤其是在药物干预研究中的应用前景。同时，这项工作也证明了一次性获取单细胞蛋白质组和代谢组信息的可行性，为未来在细胞分化、衰老和肿瘤免疫等领域的研究提供了新的工具。本文2024年发表在Analytical Chemistry上，One-Shot Single-Cell Proteome and Metabolome Analysis Strategy for the Same Single Cell。该文章的通讯作者是来自浙江大学化学系微分析系统研究所的方群教授。