免疫印迹仪实验原理

[font=宋体]免疫荧光法和免疫印迹法是生物学领域中两种常用的实验技术，它们在原理、操作过程和应用方面有着显著的区别。本文将详细探讨这两种技术的区别，以便更好地理解它们的特点和应用价值。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先，我们来了解免疫荧光法。免疫荧光法是一种利用荧光物质标记的特异性抗体来检测细胞内或细胞表面抗原的技术。其基本原理是抗原抗体反应，通过荧光显微镜观察荧光标记的抗原，从而实现对抗原的定位和定量分析。免疫荧光法具有高灵敏度、高特异性和定位准确的特点，广泛应用于细胞生物学、微生物学、免疫学等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]相比之下，免疫印迹法则是通过检测细胞或组织提取物中特定抗原的存在和分布，以了解其在生物学过程中的作用。这种方法通常涉及到蛋白质的提取、分离、转移和检测等步骤。免疫印迹法能够检测蛋白质的分子量、表达水平以及与其他分子的相互作用，为生物学研究提供了重要的信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在操作过程上，免疫荧光法主要涉及细胞的固定、通透、抗体孵育和荧光显微镜观察等步骤。而免疫印迹法则需要进行蛋白质的提取、电泳分离、膜转移、抗体孵育和显色等复杂操作。因此，从操作难度和复杂性来看，免疫印迹法相对更为繁琐。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在结果解读和应用方面，免疫荧光法能够提供直观、定位准确的抗原分布信息，有助于研究细胞的结构和功能。而免疫印迹法则能够揭示蛋白质的表达水平、分子量和相互作用，为疾病诊断、药物研发和生物学机制研究提供有力支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]此外，免疫荧光法和免疫印迹法在应用领域上也有所不同。免疫荧光法广泛应用于细胞生物学、微生物学、免疫学等领域，特别是在病毒检测、细胞信号转导和细胞凋亡等研究中发挥着重要作用。而免疫印迹法则更多地应用于分子生物学、生物化学和病理学等领域，对于研究蛋白质的结构、功能和调控机制具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]免疫荧光法和免疫印迹法优缺点介绍：[/font][/b][font=宋体] [/font][table][tr][td][font=宋体]技术[/font][/td][td][font=宋体]优点[/font][/td][td][font=宋体]缺点[/font][/td][/tr][tr][td=1,4][align=center][font=宋体]免疫荧光法[/font][/align][/td][td][font=宋体]特异性强[/font][/td][td][font=宋体]非特异性染色问题尚未完全解决[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]敏感性高[/font][/td][td][font=宋体]操作程序较复杂[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]速度快[/font][/td][td][font=宋体]需要特殊的昂贵仪器（荧光显微镜）[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]早期诊断价值[/font][/td][td][font=宋体]染色标本不能长期保存[/font][/td][/tr][tr][td=1,3][align=center][font=宋体]免疫印迹法[/font][/align][/td][td][font=宋体]操作简便[/font][/td][td][font=宋体]对于低丰度的抗原可能不够敏感[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]所需实验材料相对简单[/font][/td][td][font=宋体]无法提供抗原在细胞或组织中的定位信息[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]对某些特定抗原的检测具有较高的灵敏度[/font][/td][td][font=宋体]需要一定的实验技能和经验[/font][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，免疫荧光法和免疫印迹法是两种具有不同特点和应用领域的实验技术。免疫荧光法注重抗原的定位和定量分析，操作简便直观；而免疫印迹法则关注蛋白质的表达和相互作用，操作相对复杂但能提供深入的信息。在实际应用中，我们需要根据研究目的和需求选择合适的技术手段，以获取准确、可靠的实验结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]免疫荧光（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]IF[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]）检测服务[/b][/url]，更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

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[font=宋体][font=Calibri]Western Blot[/font][/font][font=宋体]原理：[/font][font=宋体][font=宋体]采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，[/font][font=宋体]“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜就称为一个印迹（[/font][font=Calibri]blot[/font][font=宋体]），用蛋白溶液（如[/font][font=Calibri]5%BSA[/font][font=宋体]或脱脂奶粉溶液）处理，封闭[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。本文列举免疫印迹的常见问题[/font][font=Calibri](FAQ)[/font][font=宋体]，以供参考。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1. Western blot[/font][font=宋体]结果中的背景为什么较高[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]膜封闭不够[/font][font=宋体]——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗稀释度不适宜[/font][font=宋体]——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗孵育的温度偏高[/font][font=宋体]——建议[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃结合过夜。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]膜在实验过程中干过[/font][font=宋体]——实验过程中要注意保持膜的湿润。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]检测时曝光时间过长[/font][font=宋体]——减少曝光时间。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2. Western blot[/font][font=宋体]结果中杂带较多[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。[/font][font=宋体]查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。[/font][font=宋体][font=宋体]目的蛋白有其它剪切本[/font][font=宋体]——查阅文献或生物信息学分析可能性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]样本处理过程中目的蛋白发生降解[/font][font=宋体]——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]上样量过高，太敏感[/font][font=宋体]——适当减少上样量。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗特异性不高[/font][font=宋体]——重新选择或制备高特异性的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗不纯[/font][font=宋体]——纯化抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗或者二抗浓度偏高[/font][font=宋体]——降低抗体浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3. Western blot[/font][font=宋体]结果中无信号或显示信号弱[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]检测样本不表达目的蛋白[/font][font=宋体]——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]检测样本低表达目的蛋白[/font][font=宋体]——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]转移不完全或过转移[/font][font=宋体]——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]抗体不能识别测试种属的相关蛋白[/font][font=宋体]——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗孵育时间不足[/font][font=宋体]——建议[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃结合过夜。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]二抗与一抗不匹配[/font][font=宋体]——选择针对一抗来源的种属的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]洗膜过度[/font][font=宋体]——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用[/font][font=Calibri]0.1%[/font][font=宋体]的弱去垢剂[/font][font=Calibri]Tween-20[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]其它现象：[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]膜上多处出现黑点或黑斑[/font][font=宋体]——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]反白（条带显白色）[/font][font=宋体]——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白分子量偏低或偏高[/font][font=宋体]——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]5. TBS[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]的缓冲能力强于[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]PH7.0[/font][font=宋体]以下缓冲能力较弱（不过[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]中使用[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]均可，只是要根据需要选择合适的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]6. Western[/font][font=宋体]是否可以同时加两种或者多种一抗[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]通常情况下只加一种一抗。做[/font][font=Calibri]Western[/font][font=宋体]在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，[/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体]显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，[/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体]显色、压片、洗片。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]7. PVDF[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]膜价格较贵，可重复使用，结合能力较强。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性较[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]膜差，韧性也不如[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]8. Western[/font][font=宋体]一抗的选用[/font][/b][/font][font=宋体]理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]9. Western[/font][font=宋体]抗体和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]抗体的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说用于[/font][font=Calibri]western[/font][font=宋体]的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[b]0. [/b][/font][font=宋体][b]“短路”现象的产生和处理[/b][/font][/font][font=宋体][font=宋体]如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，[/font] [font=宋体]最后结束时一般是开始的[/font][font=Calibri]1.5-3[/font][font=宋体]倍都是正常的。一般[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]和滤纸选的对就不会短路。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]11. Western Blot[/font][font=宋体]的染色[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到[/font][font=Calibri]1.5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]胶体金，灵敏度高，检测范围可到[/font][font=Calibri]pg[/font][font=宋体]级，但染色比稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]生物素化灵敏度位于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]之间，可用于任何一种膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]12. [/font][font=宋体]大分子量蛋白转移效率低的解决方法[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]可以在转移缓冲液中加入[/font][font=Calibri]20%[/font][font=宋体]甲醇（是指终浓度），因为甲醇能增加蛋白质和[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜的结合能力，同时可以延长高分子量蛋白质转移时间；转移缓冲液加入终浓度[/font][font=Calibri]0.1%SDS[/font][font=宋体]，也是为了增加转移效率；选用优质的转移膜，或使用小孔径的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜（[/font][font=Calibri]0.2[/font][font=宋体]微米）；使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]13. DAB[/font][font=宋体]显色、碱性磷酸酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗碱性磷酸酶显色原理[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]DAB[/font][font=宋体]显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，[/font][font=Calibri]DAB[/font][font=宋体]的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[b]4. [/b][/font][font=宋体][b]酶显色与荧光显色的优缺点[/b][/font][/font][font=宋体]免疫酶技术就是用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本在一定条件下反应并结合，结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时，会催化底物水解、氧化或还原，从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，但免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]，更多详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font][font=宋体] [/font]