透射模式样品进样器

随着智能穿戴设备、消费电子设备应用兴起，生物识别、物联网、自动驾驶、国防/安防等领域对光电镀膜材料的需求日益旺盛。不同行业根据使用场景，对光学镀膜的性能提出了更加多样化的需求，越来越多需要测试镀膜样品的变角度透射、变角度反射信号。传统变角度反射测试一般为相对反射率测试，需要通过参比镜进行数据传递，往往参比镜在不同角度下的绝对反射率曲线很难获取，给测试带来很大困难，同时在数据传递中也会增加误差的来源。随着智能穿戴设备、消费电子设备应用兴起，生物识别、物联网、自动驾驶、国防/安防等领域对光电镀膜材料的需求日益旺盛。不同行业根据使用场景，对光学镀膜的性能提出了更加多样化的需求，越来越多需要测试镀膜样品的变角度透射、变角度反射信号。传统变角度反射测试一般为相对反射率测试，需要通过参比镜进行数据传递，往往参比镜在不同角度下的绝对反射率曲线很难获取，给测试带来很大困难，同时在数据传递中也会增加误差的来源。本文主要介绍采用PerkinElmer紫外可见近红外光谱仪配置可变角度测试附件，直接测试样品不同角度下绝对反射率、透射率曲线，无需参比镜校准，操作简单方便，测试结果更加准确。附件为变角度绝对反射、变角度透射率测试附件，如下图所示，检测器和样品台均可以360度旋转，通过样品台和检测器配合旋转，测试不同角度下透射和反射信号。PerkinElmer Lambda1050+ 光谱仪自动可变角附件光路图图1 仪器外观图固定布局 工具条上设置固定宽高背景可以设置被包含可以完美对齐背景图和文字以及制作自己的模板下分别选取不同应用场景下的典型样品，对测试数据进行简要介绍。以下分别选取不同应用场景下的典型样品，对测试数据进行简要介绍。以下分别选取不同应用场景下的典型样品，对测试数据进行简要介绍。样品变角度透射测试采用自动可变角附件可以方便快捷的测试样品不同角度下透射数据，自动测试样品不同角度下P光和S光下透射率曲线，一次设置即可完成所有角度在不同偏振态下透射率曲线测试，无需多次操作，测试曲线如下图所示。图2 样品不同角度和偏振态下透射率测试数据样品变角度透射/反射曲线测试同一个样品，可以通过软件设置一次性测试得到样品透射和反射率曲线，如下图所示，该样品在可见波长下反射率大于99.5%，透射率低于0.5%，可同时表征高透和减反性能。图3 样品45度透射和反射曲线测试NIST标准铝镜10度反射率曲线测试采用自动可变角附件测试NIST标准铝镜10度下反射率曲线，如下图所示，黑色曲线为自动可变角附件测试曲线，红色为NIST标准值曲线，发现两条测试曲线完全重合，进一步证明测试系统的可靠性，可以准确测试样品的光学数据。图4 NIST标准铝镜10度反射率曲线测试（红色为NIST标准曲线）样品变角度全波长反射曲线测试（200-2500nm）软件设置不同的测试角度和偏振方向，自动测试样品不同角度下P光和S光偏振态下反射率曲线，如下图所示，200-2500nm整个波段下测试曲线均有优异信噪比，尤其是在紫外区（200-400nm）,可以完成各波长范围的反射性能测试。图5 样品全波段（200-2500nm）变角度反射率测试不同膜系设计的镀膜样品性能验证

2023年2月22日，清华大学朱静院士团队联合复旦大学车仁超教授和北京大学李源副教授在《自然》杂志上发表了题为” Topological spin texture in the pseudogap phase of a high-Tc superconductor” [1] 的文章。该研究工作采用赛默飞透射电子显微镜（TEM）首次在赝能隙态YBa2Cu3O6.5材料中发现了拓扑磁涡旋结构的存在。该拓扑磁涡旋结构的发现在实空间微观尺度上给赝能隙态下的时间反演对称性破缺提供了的直接图像证据，并且发现该拓扑磁涡旋结构在电荷密度波态时被破坏，进入到超导态时又重新出现，这一发现对揭示高温超导的微观机理具有重大的意义，而先进的透射电子显微镜在这一发现上更是功不可没。朱静院士，车仁超教授等人深耕于超导材料研究领域，洛伦兹低温原位透射电镜研究领域，电子显微学研究领域多年，取得了一系列重要研究成果。在本研究中，研究团队利用复旦大学电子显微镜实验室新安装的Spectra 300透射电子显微镜开展低温洛伦兹样品测试，获得了此次重大发现。2021年，赛默飞上海纳米港（Shanghai NanoPort, Thermo Fisher Scientific）有幸参与其中部分实验工作，在创建冷冻实验环境和原位数据采集方面积极地配合支持。本文将主要介绍两种电子显微学技术——洛伦兹透射电镜（LTEM）和积分差分相位衬度（iDPC）在该工作中起到的关键作用。洛伦兹透射电镜（LTEM）正常TEM光路下，物镜处于开启状态，样品在物镜上下极靴中间处于~2T的强磁场中，样品本征的磁结构会被物镜的强磁场破坏。为了在无磁环境下观察样品本征的磁结构，赛默飞场发射透射电镜Talos和球差校正透射电镜Spectra都可以通过关闭物镜电流使样品处于零磁场环境，再由位于物镜下极靴内部的洛伦兹磁透镜实现对样品微观本征磁结构的观察。LTEM成像模式主要有两种：Fresnel成像模式和Foucault成像模式。Fresnel成像模式是通过改变图像的离焦量实现对磁畴或畴壁的观察。其图像主要特点是欠焦和过焦条件下磁畴畴壁的衬度是相反的，而正焦图像则没有磁衬度。Foucault成像是通过遮挡或者保留后焦面上与磁畴相关的衍射信号来实现（类似于暗场像）, 适用于观测不同磁化取向的磁畴。图1a-c分别为该文章中赝能隙态YBa2Cu3O6.5样品的正焦、过焦以及欠焦下的Fresnel图像，离焦量为±1.08 mm。其反转的衬度特点，切实证明了该样品中存在拓扑学特征的畴结构。此外，赛默飞透射电镜上的洛伦兹功能不仅可以实现无磁环境，还可以很方便地通过改变物镜电流来改变磁场，用于原位研究磁结构随磁场强度的变化。在本研究中，作者通过改变物镜电流对样品施加外磁场影响，拓扑学特征消失，进一步证明了该效应是由磁学特性引起的。作者通过使用强度传递方程（Transport of Intensity Equation, TIE）的相位重构技术[2]，对LTEM图像进行数据处理得到拓扑磁涡旋结构的磁场方向和相对强度分布（图1d-e, i-l）。图1m-n是由LTEM结果推测出来的两种可能的磁涡旋结构示意图。该文章中LTEM实验分别在赛默飞Spectra300，Themis和Titan机台进行了重复验证，均观察到拓扑磁涡旋结构。图1 （a-c）LTEM Fresnel模式下赝能隙态YBa2Cu3O6.5样品的正焦、过焦、欠焦图像（离焦量为±1.08 mm），样品处于300 K，零磁场环境，标尺为500 nm；（d-e）为通过TIE算法得到的磁场和磁场强度图像；（f-j）为红色方框对应的剪裁放大图像；（k-l）为单个磁涡旋结构的磁场和磁场强度图；（m-n）为两种可能的拓扑磁涡旋结构示意图[1]除了常规的LTEM成像外，赛默飞球差校正透射电镜Spectra系列可以通过物镜球差校正器对LTEM光轴进行像差校正。像差校正洛伦兹模式下可以得到优于1nm的信息分辨率，从而帮助科研工作者观察到更小的磁结构。积分差分相位衬度（iDPC）球差校正透射电镜的超高空间分辨率提供了关于拓扑自旋结构的出现与局域晶体结构之间关系的更多信息。铜基超导材料中氧原子的掺杂或缺失对材料性能具有重要的影响，直接观察到氧原子的占位对深入揭示材料微观结构与性能之间的关系具有重大的意义。然而，广泛使用的扫描透射电镜（STEM）的高角环形暗场（HAADF）图像，因其主要接收高角卢瑟福散射信号，导致轻重元素无法同时成像，C、N、O等轻原子无法观察到。STEM环形明场（ABF）像虽然能观察到轻元素，但ABF图像无法直接解读，而且存在对样品厚度要求高、图像信噪比不佳等问题。为了解决以上问题，赛默飞提出并发展了积分差分相位衬度（iDPC）技术。iDPC这一全新STEM成像模式的出现，大大提高了透射电子显微镜捕获原子的能力。iDPC技术具有能实现轻重原子同时成像，能实现低电子剂量，高分辨和高信噪比成像，图像衬度易解读等优点[3]。目前，iDPC技术已成为材料表征领域技术热点，在表征轻元素占位、二维材料、电子束敏感材料、超导体等领域具有重要的应用。iDPC成像技术现已完全集成在赛默飞球差校正电镜Spectra和场发射电镜Talos上，能实现iDPC图像的在线采集和显示。图2 (a) YBa2Cu3O6.0， (b) YBa2Cu3O6.5和(c) YBa2Cu3O6.9的原子分辨率iDPC图像[1]图2为YBa2Cu3O6.0、YBa2Cu3O6.5和YBa2Cu3O6.9的高分辨iDPC图像，可以清楚的观察到氧原子的位置，随着氧掺杂含量的不同，Cu-O链上的氧占位逐渐增加。值得注意的是赝能隙态YBa2Cu3O6.5的Cu-O链上出现了氧富集和氧缺失的有序排列。作者认为这种氧的有序排列有利于拓扑磁涡旋结构沿c轴自由排列，是观察磁涡旋结构的最佳区域。作者认为现阶段不能完全排除氧填充链激发磁性的可能。赛默飞将致力于相关电子显微学技术的研发与应用，为材料的电、磁学性能研究提供更强大的助力。作者：刘建参考文献[1] Zechao Wang, Ke Pei, Liting Yang, Chendi Yang, Guanyu Chen, Xuebing Zhao, Chao Wang, Zhengwang Liu, Yuan Li, Renchao Che & Jing Zhu. Topological spin texture in the pseudogap phase of a high-Tc superconductor. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05731-3[2] M. Beleggia, M.A. Schofield, V.V. Volkov, Y. Zhu. On the transport of intensity technique for phase retrieval. Ultramicroscopy 102 (2004) 37–49.[3] Ivan Lazi&cacute , Eric G.T. Bosch and Sorin Lazar. Phase contrast STEM for thin samples: Integrated differential phase contrast. Ultramicroscopy 160, 265-280 (2016).

透射电子显微镜是使用较为广泛的一类电镜，具有分辨率高、可与其他技术联用的优点。已广泛应用于医学、生物学等各个研究领域，成为组织学、病理学、解剖学以及临床病理诊断的重要工具之一。常规电镜样品制备包括常温化学双固定、常温脱水包埋、常规超薄切片、普通电镜观察几个步骤。样品制备过程历时约一周，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，电镜观察。所有操作均按照以下流程进行。一、试剂0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液Na 2 HPO 4 2H 2 O 35.61 g 或Na 2 HPO 4 7H 2 O 53.65 g / Na 2 HPO 4 12H 2 O 71.64 gNaH 2 PO 2 H 2 O 27.60 g 或NaH 2 PO 4 2H 2 O 31.21 g加双蒸水（ddH2O）到1000 mL0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS）0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 250 mL加双蒸水到500 mL2 % 低温琼脂低温琼脂 1.0 g加双蒸水到 50 mL加热到沸腾，溶液均匀后备用1 % 戊二醛固定液25 %（m/v）戊二醛水溶液 2 mL0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 25 mL加双蒸水到50 mL1 % 锇酸固定液2 %（m/v）锇酸水溶液 10 mL0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 10 mL包埋剂A液Epon 812 树脂 50 mL十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA） 80 mL包埋剂B液Epon 812 树脂 50 mL六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA） 44.5 mL2 ， 4 ， 6 - 三甲氨基甲基苯酚（ 2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30 ）甲苯胺蓝染液甲苯胺蓝 1 g1 mol/ L NaOH 10 mL加双蒸水到50 mL混匀过滤后使用1 % 醋酸双氧铀染液醋酸双氧铀 0.2 g加双蒸水到10 mL封口膜封口，4℃避光保存1 % 柠檬酸铅染液硝酸铅 0.265 g柠檬酸钠（含2分子结晶水） 0.352 g加双蒸水到10 mL①① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。封口膜封口，4℃保存仪器修块机 Leica EM TRIM切片机 Leica EM UC6光学显微镜 Nikon 80i 及配套拍照系统DS-L1透射电子显微镜 JEOL-1230Gatan Bioscan Camera 792低电压透射电子显微镜 JEM-1230二、实验流程一、 取材与固定A. 植物样品1. 自来水冲洗表面泥尘后，使用灭菌水清洗2-3次，置于铺有预湿滤纸的培养皿中。2. 使用干净锋利的刀片切取目标材料，所取材料体积不大于3 mm3。切取样品时应注意动作迅速、减小损伤，避免来回切拉；使用的灭菌水及器具应4℃预冷，并在操作中尽量保持低温以降低组织细胞活性。3. 将切下材料放入装有预冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽气，抽几次后轻摇小瓶，并打开瓶盖。重复2-3次，直到样品沉入瓶底。4. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。5. PBS清洗3次，10min/次。6. 1%锇酸固定液固定1h。7. PBS清洗3次，10min/次。B. 动物样品1. 4℃预冷生理盐水冲洗组织块，迅速切取组织块，体积不大于3 mm32. 将切取的组织块投入装有预冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽气直至样品沉底。3. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。4. PBS清洗3次，10 min/次。5. 1%锇酸固定液固定1 h。6. PBS清洗3次，10 min/次。C. 单层培养细胞或悬浮培养细胞样品②1. 3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清。2. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸弃上清。① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。3. 重复步骤2一次。4. 加入预冷的血清或蛋清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，留少部分，吹吸悬浮沉淀细胞。（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）5. 缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。6. 吸弃上清，刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的血清包埋块。7. 使用干净的单面刀片或手术刀，将血清包埋块切成2 mm3左右的小块，取3-5个富集细胞样品效果较好的包埋小块继续下面实验。8. PBS清洗3次，10 min/次。9. 1%锇酸固定液固定1 h。10. PBS清洗3次，10 min/次。D. 藻类及其他游离培养样品1. 吸取2%低温琼脂液200μL到0.2mL离心管，并将离线管置于冰上，取10μL枪头迅速插入琼脂中并保持离心管竖直，且枪头竖直靠中的包裹在琼脂中。2. 静置1 min，待琼脂凝固后，小心拔出枪头，形成琼脂空腔，待用。3. 3000 rpm离心5 min，收集样品，尽量多的吸弃培养液上清。4. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4min，3000 rpm离心5min，吸弃上清。5. 重复步骤2清洗，吸弃大部分上清，留极少部分上清液，吹吸悬浮样品。6. 使用10μL 移液器小心将样品加入已经制备好的琼脂空腔中，使样品充满空腔大部分，添加过程中尽量避免气泡出现。7. 吸取50μL溶化的琼脂，快速滴加到空腔琼脂上封口，冰浴5 min，待琼脂完全凝固。8. 使用单面刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的琼脂包埋块，稍作修葺。9. PBS清洗3次，10 min/次。10. 1%锇酸固定液固定1 h。11. PBS清洗3次，10 min/次。二、 脱水1. 按丙酮与灭菌水体积比3：7配制30%脱水剂。吸弃样品管/瓶中的PBS，快速加入现配的脱水剂（脱水换液过程禁止出现样品暴露空气中现象，可不全部吸完，略有剩余，使样品浸润；动作应迅速准确），室温放置或摇床轻摇45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的浓度梯度进行脱水。2. 配制50%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。3. 配制70%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。4. 配制90%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。5. 使用纯丙酮快速换液，室温轻摇30 min③。6. 重复步骤5一次。三、 渗透包埋在此步脱水操作完成后即可开始配制渗透用包埋剂，以免安排不周。样品浸泡在纯丙酮中时间不宜过久，以免造成样品较脆，不利于超薄切片。1. 配制渗透用树脂包埋剂1) 取干净的10 mL注射器，拔去活塞，用封闭针头堵住注射口，放于通风橱中。2) 小心倾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心倾倒A液1 mL。3) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色均匀，无丝状液体。4) 小心拔去活塞，通风橱中操作，缓慢滴加14滴DMP-30。5) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色完全均匀，无丝絮状分色，竖直放置待用。2. 按照包埋剂与丙酮体积比3：7配制30%渗透剂，快速吸弃样品管中纯丙酮并加入渗透剂，轻摇渗透3 h。3. 按照包埋剂与丙酮体积比7：3配制70%渗透剂，快速换液，轻摇渗透过夜。4. 重新配制包埋剂，并小心推按注射器，将包埋剂挤到包埋模具中至液面略凸。5. 解剖针挑取样品到纯包埋剂中，渗透3 h。6. 小心挑取样品，滤纸上稍微沾下吸弃部分粘附的包埋剂，轻轻放置到未渗透过样品的包埋孔中，小心将样品按到底，摆放好位置。记录各样品对应包埋块编号。7. 梯度温度聚合包埋1) 37℃烘箱中12 h，期间定时观察样品有无漂移现象，如有，则再次小心摆放样品位置。2) 45℃烘箱中12 h。3) 60℃烘箱中24 h。四、 修块与切片1. 拿到包埋块后检查样品位置是否得当，选取位置好的包埋块优先进行修块、切片。2. 粗修包埋块1) 使用六角扳手将包埋块固定在样品头上，露出长度合适。2) 将样品头固定在修块机上，体视镜观察修块，分四个方向将包埋块头部多余的包埋剂修去，暴露出组织块。3) 使用锋利的单面刀片修去组织块周围毛刺的包埋剂，使其四边光滑清晰。4) 卸下样品头装至切片机上，使用玻璃刀修片，直至样品表面光滑清晰。3. 半薄切片1) 将粘有水槽的玻璃刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见900nm厚度切片反光为亮绿色。6) 待有切片下来形成4-6片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，放到干净载玻片上，酒精灯略微加热，使水蒸干，并对着光亮用记号笔标示切片所在位置。4. 半薄切片染色1) 吸取20μL甲苯胺蓝染液，滴加到载玻片放有切片的位置，室温静置30 s 。2) 去离子水冲洗玻片，直至不再有蓝色。吸水纸上沥干，酒精灯略微加热，加速切片上的水分蒸发。3) 显微镜观察切片质量和样品位置。5. 精修包埋块1) 移去装有水槽的玻璃刀，取下装有包埋块的样品头，装至修块机上。2) 根据半薄切片结果，使用新的锋利刀口，小心修理包埋块四边，使其尽可能的光滑、平整。6. 超薄切片1) 将钻石刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的干涉光谱颜色一致；继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见70nm厚度切片反光为亮灰色及浅灰色。6) 待有切片下来形成10-20片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，轻轻放到干净载膜铜网上，用尖角滤纸靠近铜网边缘缓慢吸干水分。8) 轻轻移去捞片环，将载有切片的铜网放到铺有滤纸的平皿中，晾干待染色观察。五、 染色1. 醋酸双氧铀染色1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。2) 将放有切片的载网小心放到染色盘上，有切片面靠上，并稍微用镊子按载网边缘，使其与染色盘接触粘附牢固。3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色30 min。4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。6) 重复清洗2次。2. 柠檬酸铅染色1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。④2) 在放置染色盘的平皿中放入2片固体NaOH，用以吸收平皿中CO2气体。3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色8 min。4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。连续染色时，载网不需要从染色盘上拿下，清洗后直接进行铅染即可，但是铅染液要现用现取。6) 重复清洗2次。7) 小心夹取载网，放置到铺有滤纸的干净平皿中，晾干待电镜观察。六、 电镜观察1. 取出样品杆，打开样品夹，小心放入载网，合上样品夹，并转动样品杆，轻敲确保样品夹已准确固定载网。2. 将样品杆插入透射电镜样品室，开始抽气。3. 打开灯丝开关，等待检测电流出现后，打开观察窗开始观察。4. 先在低倍下找到切片，再高倍观察切片，寻找待看目标，仔细对焦。5. 将切片目标区域遇到观察窗中间后，调整灯丝电流密度为3.8 pA/cm2。6. 插入拍照CCD，Start View，微调焦距，Start Acquire 拍照。7. 拍照完毕，按格式需求保存照片到指定文件夹。8. 使用专用写保护闪存盘拷贝数据到公共电脑观察、使用。三、应用领域1、材料领域材料的微观结构对材料的力学、光学、电学等物理化学性质起着决定性作用。透射电子显微镜作为材料表征的重要手段，不仅可以用衍射模式来研究晶体的结 构，还可以在成像模式下得到实空间的高分辨像，即对材料中的原子进行直接成像，直接观察材料的微观结构。