原位加热与电学芯片系统

[color=#000000]原位电镜（in situ transmission electron microscopy）是一种在电子显微镜下实时高空间分辨率观察和记录材料或样品在不同条件下变化的技术，这种技术的应用涵盖了多个领域，包括材料科学、纳米科技、生物学等。特别是得益于气体和液体环境的引入，大大的拓展了原位电镜技术的应用范畴，如腐蚀科学和催化反应等。电子显微镜本身具有非常高的真空工作环境，因此，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]反应介质通常被密封在一个非常小的纳米反应器里面。由于氮化硅（SiNx）具有易于微纳米制造且在一定厚度下仍有可靠的力学特性及适度的电子透明度等优点，被广泛应用于原位电镜中芯片用的密封膜材料。[/color][color=#000000]在过去20年，基于像差校正器、单色器及直接探测器等硬件技术的发展，电子显微镜本身的性能包括空间和能量分辨率都得到显著提升。但是原位电子显微学直到目前为止，在空间分辨率上并无显著突破。关键原因是作为密封的SiNx膜材料限制了电镜本身及原位实验的品质因子。目前商用的SiNx膜的厚度一般为50 nm，而[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]电子显微学一般需要用两个原位芯片，这样仅密封膜的厚度就高达100 nm。如此厚的密封膜会造成非常高的有害电子散射，大大降低了原位电子显微学实验中采集的各种数据的信噪比。在原位电子显微学领域，学者们都一直认为降低SiNx膜的厚度非常必要，但是直到目前仍很难实现，因为仅通过刻蚀降低SiNx膜厚度，会造成力学性能的显著恶化。[/color][color=#000000]针对此问题，[b]美国西北大学的Xiaobing Hu[/b]和[b]Vinayak Dravid教授[/b]研究团队从自然界蜂窝结构稳定性获得灵感，巧妙利用[b]掺杂浓度对Si的刻蚀速率影响，在观察窗口区域引入了额外的微米尺度Si支撑图案，成功的将SiNx膜的厚度从50 nm降至10 nm以下。[/b]这种在窗口区域具有支撑图案的超薄原位芯片具有很多优点，如优异的力学性能、耐电子束辐照、充分大的可观察区域，保证了该超薄芯片在原位电子显微学上的广泛应用。基于Pd的储氢特性，作者系统了探索了超薄芯片对原位实验测量品质因子的影响，及Pd纳米颗粒的吸/析氢行为。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/c12df4c5-8db9-4fce-8ddf-16d17cfd42fd.jpg[/img][/align][align=center][size=14px][color=#7f7f7f]图1. 超薄原位电镜用芯片的制备及其优异的力学稳定性和电子束耐辐照性能，插图A、C中标尺分别为10 mm, 100 μm[/color][/size][/align][color=#000000]图1A显示超薄芯片的制备过程，图1B显示了具有不同厚度的SiNx窗口的原位芯片。图1C的扫描透射模式下的暗场和明场像显示出超薄芯片窗口区域的蜂窝状特征。图1D显示出这种超薄芯片优异的力学特性，即使在5 nm厚的情况下，仍能承受1个大气压，完全满足绝大多数的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]原位实验。图1E显示出超薄芯片非常好的耐电子束辐照特性，当厚度从50 nm降到10 nm时，临界电子束剂量几乎没有改变。图1E为用光学方法和电子能量损失谱测量的不同厚度的SiNx膜数据。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/6f3b49eb-f7b1-4f8f-8a5f-362aa1e61846.jpg[/img][/align][align=center][size=14px][color=#7f7f7f]图2. 基于超薄原位芯片的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]电子显微学实验品质因数的显著提升[/color][/size][/align][color=#000000]图2A为理论模拟不同厚度的SiNx对Au纳米颗粒明场像信噪比的影响，对于超薄原位芯片而言，即使在电子剂量比较低的情况下，仍可以拥有很好的信噪比，成像质量比较高。图2B、C显示出在一个大气压的Ar环境不同SiNx膜厚度下的高分辨像对比。可以看出与常规50 nm厚的原位芯片相比，超薄芯片的应用不仅提高了图像的信噪比，分辨率也从2.3 ?提高到1.0 ?。图2C显示出了能谱对比结果，可以看出在一个大气压的Ar环境下，当原位芯片窗口区域膜厚度从50 nm 降低到10 nm时，Ar/Si峰值比从0.59%升到8.3%，提高了14倍以上。图2E-G数据显示了超薄原位芯片显著提高了电子能量损失谱分析的灵敏度。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/6d6e2657-12c9-4711-80d5-725e65b1eeb9.jpg[/img][/align][align=center][size=14px][color=#7f7f7f]图3. 基于超薄原位芯片电子显微学在储氢材料中应用[/color][/size][/align][color=#000000]图3A、3B为在不同支撑载体下纳米Pd颗粒的电子衍射对比图，可以看出超薄芯片显著压制了膜材料本身的有害电子散射，提高的电子衍射的信噪比。而这也允许研究人员在原位[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]实验中进行定量衍射分析。图3C-D的原位电子衍射，显示出Pd纳米颗粒在原位充氢、放氢过程中的相变行为。图3E的电子能量损失谱分析确认了相变产物PdHx的产生。[/color][color=#000000]基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]超薄原位芯片的设计与探索实验，作者提出这种超薄芯片的设计策略可大规模推广到[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]原位及其它基于SiNx的原位芯片上，大大提高原位电子显微学实验的品质因子，从而允许研究人员在原位实验过程中不单单观察形貌变化，可将其它先进电子显微学方法应用到原位实验上来。更进一步，这种超薄芯片也可拓展到原位X射线领域。可以说，超薄芯片的概念提出，将大大的影响整个原位实验领域。[/color][color=#000000]这一成果近期发表在[b][i]Science Advances[/i][/b]上，美国西北大学[b]胡肖兵研究副教授[/b]，[/color][color=#000000][b]Vinayak Dravid讲席教授[/b][/color][color=#000000]为文章的通讯作者，[b]Kunmo Koo博士[/b]为文章的第一作者。[/color][来源：材料学网][align=right][/align]

基因芯片及其在病原微生物检测中的应用基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术，它以其能够快速、高效、大规模地同步检测生物遗传信息的卓越功能而得到发展。在基因测序、基因表达分析、药物筛选、基因诊断等领域显示出重要的理论和实用价值。基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术。在固相支持物表面（常用的固相支持物有玻璃、硅片、尼龙膜等载体）有规律地合成数万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”或液相合成探针后由点样器有规律地点样于固相支持物表面；然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或用cDNA同位素或荧光物标记后，与固相支持物表面的探针进行杂交，通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描，对这些杂交图谱进行检测；再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理，便可得到目的材料中有关基因表达信息。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析。基因芯片分类基因芯片按其片基不同可分为无机片基芯片和有机合成片基芯片：如果按其应用不同，可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片；如果按其结构不同可分为DNA阵列和寡核苷酸芯片；如果按其制备方法不同可分为原位合成芯片和合成后交联芯片。目前，常用于基因芯片制作的固相支持物主要包括半导体硅片、普通玻璃片、尼龙膜等基质。它们各有优缺点，可根据不同的用途和目的选择使用。用硅片制作的芯片，其DNA探针排列的密度高，在1.28cm芯片上，可达40万点阵。检测灵敏度高但专一性差。用玻璃制作的芯片，可用于双色荧光标记杂交，便于杂交信号的检测，但其灵敏度低，而且对玻璃片的处理要求高。尼龙膜主要用于制作eDNA芯片，即将不同的eDNA片断点阵于尼龙膜上，它可用同位素标记检测，灵敏度高，专一性好，但是DNA阵列的密度低。DNA探针的制备及固化探针的制备及固化有2种方法：①在片基上原位合成寡核苷酸；②在片基以外制备DNA探针，并以显微打印等手段将其固化于片基上。作者介绍了待测DNA样品的制备、标记样品与基因芯片杂交、杂交信息的检测与分析、操作过程中存在的问题及解决办法。基因芯片可以对病原细菌检测、病毒的检测及其他方面如支原体检测等。问题和展望基因芯片在病原微生物检测中具有快速、灵敏、高通量、自动化等特点。但目前仍面临一些问题有待解决，这些问题主要体现在硬件和软件2个方面。在硬件方面，DNA芯片技术需要昂贵的尖端仪器，如生产原位合成芯片需要光刻机器和寡核苷酸合成仪；构建DNA微集阵列的自动仪器约需8万美元以上，而检测芯片则要激光共聚焦显微镜、落射荧光显微镜等设备，费用较高。在软件（即技术）上也存在一些问题。首先，探针制备的环节上，原位合成寡核苷酸技术复杂，且有专利保护，合成过程中有可能插入错误核苷酸或混入杂质，降低了特异性和信噪比；显微打印技术较灵活，易实现，但需收集或合成大量探针，且阵列的集成度不高。其次，在样品和芯片杂交的环节上 ，因为杂交在固相上进行，空间因素会对杂交造成不利影响；还有，在一个芯片上存在多种探针，这对杂交条件是个挑战，因为这种探针的最适条件未必适合另一种探针；而且，复杂的探针如长寡核苷酸容易自身形成二 、三级结构，影响与靶序列的杂交或给出错误的阴性信号，当然在其它技术环节上也存在着一些难题，如样品准备复杂、检测的灵敏度低等。虽然基因芯片技术在多个环节上有待提高，但它在生命科学及相关领域中已呈现出广阔的应用前景，相信随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片会成为基础研究和临床应用的强有力工具。

1 原位光刻合成寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。　　2 原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。　　3 点样法 点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置；多个打印/喷印针的打印/喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置；针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好, 打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。国外有多家实验室和公司研究开发打印/喷印设备，目前有一些已经商品化。军事医学科学院目前正在利用打印/喷印技术进行生物芯片的研究和开发，预计2年内将有用于实验室研究或临床诊断的基因芯片产品问世。　　4 电子芯片电子芯片是由美国Nanogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化，制成1mm(1mm的阵列、每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氮化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将链连接亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片的最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时间。制备复杂、成本高是其不足。　　5 三维芯片三维芯片是由美国的Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家机构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。三维生物芯片的实质上是一块显微镜载玻片，其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶DNA，RNA和蛋白质的分析。先把已知化合物加在凝胶条上，用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到0.2nl的体积打到凝胶上。以上几家机构构合作研究的生物芯片系统具有其它生物芯片系统不具有的几个优点。一是凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。二是可以在芯片上同时进行扩增与检测。一般情况下，必须在微量多孔板上先进行PCR扩增，再把样品加到芯片上，因此需要进行许多额外操作。本芯片所用凝胶体积很小，使PCR扩增体系的体积减小1,000倍(总体积约纳升级)，从而节约了每个反应所用的PCR酶(约减少100倍)。三是以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然状态在凝胶条上分析，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。　　6 流过式芯片(flow-thru chip) Gene Logic 正在开发一种在芯片片基上制成格栅状微通道，Gene Logic设计及合成特定的寡核苷酸探针，结合于微通道内芯片的特定区域。从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记，然后，该样品流过芯片，固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸，采用Gene Logic's信号检测系统分析结果。流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化，其特点在于(1)敏感性高：由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化；(2)速度快：微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间；(3)价格降低：由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。