抗生素分离纯化活性成分纯化中压层析系统

大家好：我现在在做一个化学药物的合成，是抗生素的，酰化反应，反应完全后，有2个副产物，根据液相，用ph8的缓冲液：乙腈=95:5时，底物在5分钟出峰，产物在4分钟出峰，副产物在2.5分钟出峰，不懂怎么样分离纯化，这个物质可能是成了盐了，因为在这过程中我加入碳酸氢钠来做酰化反应的缚酸剂，产物和副产物易溶于水、乙醇、甲醇少量不溶解，真不懂该怎么办，我想上树脂，上了一下硅胶柱，氯仿：甲醇=5:5时，好像都出来了，真不懂该怎么办啊，如果上树脂的话，还有什么树脂可以选择的啊？请高手指点一下！！！不胜感激！

一． 逆流色谱技术简介现代逆流色谱技术起源于上世纪50年代的逆流分溶法（Counter Current Distribution, CCD），它利用不同物质在所选择的两相溶剂中的分配系数不同而通过多次逆流分溶对物质进行分离。它采用数百个分离管进行操作，每一次操作后，上层液体被转移至盛有新的下层溶剂的分离管中，而往原分离管中加入新的上层溶剂，看起来好似两相的液体以相反的方向流动，故称为逆流分溶法。逆流分溶法存在许多缺点，如使用易破碎的玻璃仪器，分离时间长，需要连续稀释样品等。但与液相色谱相比，它无需固体作固定相，从而避免了因此而带来的一系列问题。因此，在CCD基础上发展起来的逆流色谱（Counter Current Chromatography, CCC）在采用了与液相色谱相似的连续洗脱、检测和分布收集技术后从上世纪70年代开始得到迅速的发展，并在天然和合成化合物的分离纯化中发挥了日益重要的作用。上世纪70年代出现的液滴逆流色谱（Droplet Counter Current Chromatography, DCCC）使流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。其装置主要由输液部分、检测收集部分和玻璃管液柱部分（300-500根60cm X 1.8mm的玻璃管）组成。由于流动相形成液滴，在细的玻璃管中与液体固定相有效地接触，摩擦不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，所以分离效果好，而且不产生乳化现象。对于易氧化的物质，还可用氮气驱动流动相。采用DCCC分离纯化了许多包括中草药和抗生素在内的天然产物如柴胡皂甙和短杆菌肽, 短杆菌酪素和四环素等。液滴逆流色谱解决了操作自动化的问题，但仍存在分离时间长，使用易破碎的玻璃管，分离度还不高等问题。逆流色谱技术的重大突破出现在上世纪80年代，根据被分离混合物的理化特性，选择二元或多元的两相溶剂体系，以上相或下相为固定相，将其注满色谱柱后使色谱柱作特定的高速旋转运动，并用由此产生的离心力场支撑柱内的液体固定相，然后以另相为流动相，携带溶解的混合物由输入泵推入色谱柱，穿过两个液相对流的管柱，各组分根据在两相中的分配系数不同而得到分离。根据离心力场的不同可将现代逆流色谱分为离心分配色谱(Centrifugal Partition Chromatography, CPC)，也称盘管行星离心色谱(Coil Planet Centrifuge, CPC)和高速逆流色谱(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)，前者属流体静力平衡系统，色谱柱由一系列刻在圆盘或圆筒内的导管相联的柱体组成，通过单轴旋转产生恒定的重力场，两个旋转密封的接口分别连接流动相的进口和出口；后者属流体动力平衡系统，由聚四氟乙烯软管绕制成的色谱柱除绕离心轴旋转外，还围绕自轴旋转，产生变化的重力场，并采用无旋转密封的连接方式。分离时两相液体被剧烈振动的离心力场依其界面特征被甩成极细的微粒，样品各组分在两相微粒的表面上分配并在微粒振荡与对流的环境中有效传递，相当于把通常的溶剂萃取高效（13次/秒以上）、自动、连续地予以完成。泡沫逆流色谱(Foam Counter Current Chromatography, Foam CCC)技术是在HSCCC的基础上发展起来的。使用时，氮气和流动相同时从相反方向注入管柱中形成气体和流动相的逆流，然后从盘管中部注入的混合物根据形成泡沫的能力得到分离，易形成泡沫的的组分随[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]被洗脱收集在泡沫流出部分，而其它组分则随流动相流出。在盘管行星离心色谱基础上还发展了交叉轴盘管行星离心色谱(Cross-axis Coil Planet Centrifuge, X-axis CPC)，这种仪器在使用中产生一种行星式运动，使得盘管支架在围绕离心中轴转动（公转）的同时还沿着自己的水平方向轴旋转（自转），使得部分的离心力矢量作用于盘管的半径方向，以防止因两相乳化而降低固定相保留率的现象出现。因此，X-axis CPC大大稳定了固定相的保留率，特别适用于大量制备性分离纯化。现代逆流色谱技术为化合物的分离纯化提供了一个新的手段，与HPLC等液-固色谱技术比较，由于分离原理不同，二者间存在很强的互补性。它无需固体作固定相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的1/10以下），运行使用的后续投入较低。逆流色谱在无需更换不同极性的色谱柱情况下，通过提高极性溶剂或非极性溶剂比例的方法，可以实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化。由于色谱柱容积大，无填料，柱内空间全部是有效空间，因此，样品负载能力强，制备量大，重现性好。实验室规模的盘管总体积为100mL的逆流色谱仪一次可分离0.5-2克的粗品，而3000mL容量的制备型逆流色谱仪一次可分离15-60克的粗品。但是，与[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]和高效液相色谱等相比，逆流色谱的分离效率即理论塔板数还不高（一般在1000以下），一次分离所需时间还较长（以小时计），因此，还不宜用于组成复杂的混合物的全谱分离分析。逆流色谱技术在基本原理以及溶剂系统选择等方面还有待于进一步的普及、研究、开发与应用。目前，HSCCC等技术在生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物以及无机离子等众多领域已得到成功应用，1996年美国出版的《High-Speed Countercurrent Chromatography》一书被选编为著名的分析化学丛书第132卷，2000年9月在英国Brunel大学召开了逆流色谱技术第一届国际学术会议，每年一度的国际分析化学与应用光谱学学术会议上，都设有CCC的专题组，“Journal of Chromatography” ,“Journal of Liquid Chromatography” 等重要学术刊物都有这一技术的论文发表。我国在CCC技术及其应用研究方面与国际发展同步，1980年研制出了我国第一台逆流色谱仪，并用于国产抗敌素成分的分离与分析检定，发表了一大批用HSCCC等分离制备中草药和茶叶等天然产物活性成分的论文，引起国际同行的瞩目，2002年在北京召开了逆流色谱技术的第二届国际学术会议。但是，在逆流色谱技术应用于抗生素的分离纯化方面，我国与国际上发展趋势相比还存在很大差距，相关论文甚少，因此，在我国开展高速逆流色谱技术分离纯化抗生素的工作有着广阔的应用和发展前景。二． 溶剂选择无论是用HPLC或CCC技术分离混合物，分离度(Rs)是一个很重要的参数，如下图所示，在HPLC中，提高分离度是通过使峰形变窄的方法达到的，而在CCC或CPC中，则是通过改进选择性来实现的，这种选择性主要取决于样品在两相溶剂中的分配系数。因此，溶剂系统的选择在CCC技术中尤为重要。 选择溶剂时要考虑到样品的极性、溶解度、电荷态和形成复合物的能力等，溶剂体系的沉降时间应小于30秒，以得到满意的固定相保留率。测定方法如下，各取2毫升平衡后的上相和下相液体移入一个5毫升的刻度玻璃管中，密封上下摇动5次后静置于水平面上并测定两相分层的时间即沉降时间。样品的分配系数K值（K=上相中样品浓度/下相中样品浓度，可由HPLC方法得出）最好在1左右，一般在0.2到2之间。以上相作固定相时为例，若K《《1，样品很快随流动相流出，达不到分离效果；若K》》1，样品出峰时间拉长，形成宽峰。由于CCC的理论塔板数在800左右，因此要得到高的分离度，样品各组分间的分离因子( , 各组分的K值之比)应大于1.5。此外，两相溶剂的体积应尽量相同以避免溶剂的浪费，溶剂最好挥发性强，这样完成操作后只要将洗脱液浓缩即可得到纯样品。 选择溶剂体系时，首先选出一个能使样品全部溶解的溶剂体系，然后调整各溶剂的比例使得被分离各组分满足K值和 值的要求，以提高分离度。可以采用相图来研究改变某一相的组成对另一相组成的影响，Sø rensen等人对近百种三元溶剂相图研究后，总结归纳出三类溶剂体系：乙酸乙酯—正丁醇—水(EtOAc—BuOH—H2O)，适用于极性弱的样品；水—二甲亚砜—四氢呋喃(H2O—DMSO—THF)，适用于极性强的难溶性样品如两性霉素B；氯仿—甲醇—水(CHCl3—MeOH—H2O)，适用于大部分样品。此后又发展了其它通用的多元溶剂体系如正戊烷—乙酸乙酯—甲醇—水(Heptane—EtOAc—MeOH—H2O)体系和正戊烷—甲醇—甲基叔丁基醚—甘醇二甲醚—水(Heptane—MeOH—MtBE—Glyme—水)体系等。常用溶剂体系的选择可参考表1，首先根据样品的理化特性选出最佳溶剂，然后在左右两栏中再选择相应的数种溶剂，以组成选择性最好的多元溶剂体系。

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]