当前，单克隆抗体和重组蛋白等蛋白质类生物药物广泛应用于治疗各种严重威胁人类生命的疾病，包括癌症和自身免疫性疾病。蛋白质治疗远远比小分子药物的治疗复杂，因此，阐明这种复杂性成为一个分析难题。 本文使用配备 DAD 检测器的 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案，论证了采用全二维液相色谱 (LCxLC) 分析单克隆抗体胰蛋白酶酶解物的应用潜力。

2.7 μm Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱专为改善多肽分离和肽图分析应用而设计。该色谱柱采用了表面多孔技术，能够实现复杂多肽混合物的快速有效分离。本文以重组人促红细胞生成素(rhEPO) 的胰酶分解物作为糖肽分析的消化物模型，展示了AdvanceBio 肽图分析色谱柱卓越的肽图分析性能。与很多蛋白治疗药物类似，rhEPO 在生产过程中发生了修饰，因此表现出广泛的异质性。AdvanceBio 肽图分析色谱柱采用了优化的 C18 涂层技术，能在一个很宽的洗脱范围内为多肽分析提供卓越的选择性和分离度，以增强糖肽片段的分离，从而实现其快速、有效和灵敏的质谱分析。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µm 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

为了以更安全的剂量水平实现更好的疗效，新开发的生物治疗药物变得越来越复杂。为支持这类药物的开发，需要使用灵敏度和选择性更高的分析方法，达到更低的检测限。 而样品接触到样品板、样品瓶或移液枪头等实验室器皿时发生的非特异性结合(NSB)或吸附，是单克隆抗体(mAb)等疏水性生物大分子的分析中经常出现的问题。这种现象与分子的理化性质有关，通常在低浓度下更为明显。样品的非特异性吸附可能导致回收率降低、分析物损失、分析方法重现性差，最终导致分析达不到所需的检测限。因此，尽可能减少非特异性结合非常重要。

单克隆抗体 (mAb) 作为治疗药物具有重要意义，因此人们对能够表征这种复杂分子的高分离度分析方法的需求正不断增长。mAb 的一个重要特性是它的电荷状态可能会在生产过程期间和之后发生变化。而毛细管等电聚焦 (cIEF) 正是一种非常有效的测量 mAb 电荷异质性的方法。本应用简报中展示了如何利用 Agilent 7100 CE 系统的 cIEF 对 mAb电荷异构体进行高分离度的分析。

采用SPD-M30A检测器，实现高灵敏度检测；采用等度洗脱分离苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），基线稳定，保留时间重复性好，降低分析成本；符合FDA 21 CFR Part11要求的完备功能；简单、方便的数据分析功能。

通过自制脱盐装置对蛋白质药物注射用重组人促红素原液（CHO细胞）进行脱盐处理，应用蛋白质测序仪PPSQ-53A进行重组人促红素的N-末端氨基酸序列分析，避免了盐分干扰和对仪器的损害，成功测定了样品N-末端前15个氨基酸的序列，结果与理论一致，表明使用PPSQ可以检测蛋白质的N-末端序列，是生物技术药物研发和质控管理中具有重要作用的分析手段。

随着生物制药和绿色食品产业的发展，酶催化合成已经成为一股强劲的技术潮流，吸引了很多的技术人员和资金的投入。能否将高效的微反应技术和酶催化技术集成，应用于高效绿色合成过程呢？