饲料中猫源性成分鉴定检测方案(离心机)

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纳诺仪器nano instrument上海农业学报 2013，29(4)：56-59Acta Agriculturae Shanghai (纳诺仪器nano instrument上 海 农 业 学 报 文章编号：1000-3924(2013)04-056-04 食品和饲料中猫源性成分实时荧光 PCR 检测方法 张舒亚，韩 丽，于 翠，张 坤，姚静梅，张 燕 (上海出入境检验检疫局，上海200135) 摘 要：采用实时荧光 PCR方法对食品和饲料中猫源性成分进行 TaqMan 探针检测。结果表明：该检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点，在动物和植物材料基质中，均能检出0.01%的猫源性成分，适用于市售食品和饲料中猫源性成分的检测。 关键词：饲料；猫；实时荧光 PCR方法；检测 中图分类号：TS201.6 文献标识码：A Detection of cat derived components in food and feed by real-time PCR ZHANG Shu-ya，HAN Li， YU Cui，ZHANG Kun， YAO Jing-mei，ZHANG Yan (Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China) Abstract：A real-time PCR method was established to detect cat derived components in food andfeed. The test results showed that the detection method was high in specificity and sensitivity andcould detect 0.01% cat derived components in animal and plant matrixes，being suitable for detectionof cat derived components in commercially available food and feed. Key words：Food；Cat；Real-time PCR；Detection 在动物产品原料加工过程中，经常出现动物成分的掺假、造假和无意污染现象。猫是人类不常食用的动物，其本身携带有狂犬病等人畜共患病，具有传播疾病的风险。2005年上海街头曾发发用流浪猫肉制作的羊肉串，食用不常食用的猫肉，可能会引发传播疾病，具有食用性风险。对于动物饲料，为防止疯牛病的发生，世界各国均规定反刍动物饲料中禁止含有哺乳动物成分；如果反刍动物饲料中混有猫源性动物成分，可能会具有发生疯牛病的风险。猫作为一种人们饲养的哺乳动物(宠物)，数量非常大，对食用和饲料用的影响越来越大，所以有必要建立食品和饲料中猫源性成分检测方法。目前，国内外对猫源性成分检测研究报道较少，Martin 等建立了饲料中猫源性成分检测的普通 PCR 方法，国内还未有对猫源性成分检测的研究报道。本研究采用实时荧光 PCR 方法对食品和饲料中的猫源性成分进行检测，为食品和饲料中猫源性成分鉴别提供技术支撑。 1 材料与方法 1.1 材料 用于猫源性成分特异性检测样品：猫肉、狗肉、牛牛、猪猪、山羊肉、绵羊肉、梅花鹿肉、骆驼肉、马肉、驴肉、兔肉、野兔肉、野猪肉、貉肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、火鸡、鸽子、鹌鹑、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草虾、螃蟹、草鱼、牡蛎、贻贝、蜗牛等29种动物材料由本实验室保存；大豆、玉米、大麦、小麦、大米、马铃薯、番茄、豌豆、苹果、胡萝卜等10种常见植物材料购自上海市农贸市场场超市。 用于实际应用检测的样品：猫肉来自个人提供，10份烤肉串购自上海马路地摊，在2家广州野味饭店各购5个肉样品，在3家上海小餐馆各购5个肉块或肉串样品，20份澳大利亚、秘鲁等国进口肉骨粉、鱼粉等等料，10份国内市场饲料，20批购自上海市农贸市场场超市的其他成分食品(肉干、肉酱、饼干、罐头罐)。 ( 收稿日期：2012-04-18 ) ( 项目基金：上海出入境检验检疫局科研项目(沪科06-08)；上海科委技术标准专项(06DZ05033)资助 ) ( 作者简介：张舒亚(1978-)，女，硕士，高级工程师，主要从事动植物与食品分子生物学检测技术研究。 E-mail：zhangshuya@shciq. gov.cn ) 1.2 证试剂 DNA提取取剂盒：Wizard Magnetic DNA Purification system for Food (Promega 公司 CAT#FF3750)， Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega 公司 CAT.#A1250)。实时荧光 PCR 混合液： Taoman Gene Expression Master Mix(AB 公司， Part No.4369016)。PCR 预混合液：Premix ExTaq Version2.0(TaKaRa公司，Code：D332A)。 根据猫线粒体基因组 12S rRNA 基因核酸序列(GenBank 编号为：U20753)设计猫源性检测引物和探针，猫源性检测引物和探针序列：5'-AGCACGAAAGTAACTTTAACACCTCC-3'、5'-TGCTAG-TAGTTCTCTGGCGGATAG-3'和5'-FAM-ACTACACGACAGCTAAGA-MGB-3'. 18S rRNA 检测引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3'和 5'-AATTTGCGCGCCT-GCTGCCTTCCTT-3’， 1.3 仪器设备 ABI 7300 实时荧光 PCR 仪；PCR仪；移液枪；离心机；恒温孵育器；冷冻碾磨机；DNA冷冻干燥离心机；核酸蛋白浓度分析仪；Eppendorf离心管；PCR反应管。 1.4 样品制备 用冷冻研磨机将上述动植物材料研磨成粉状。将磨成粉末状的羊肉和小麦，于120℃烘干6h。用羊肉粉和小麦粉分别配成配肉粉含量为 0.01%(W/W)的混合样品。 1.5 DNA 的提取 根据 Wizard Magnetic DNA Purification system for Food DNA提取试剂盒提取除血样外的样品DNA。用 WizardGenomic DNA Purification Kit DNA 提取试剂盒提取猫肉 DNA. 1.6 DNA浓度测定及配制 用德国 Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白分析仪测定抽提样品 DNA 的浓度。 用小麦 DNA溶液(浓度：100ng/uL)将抽提的猫肉 DNA 溶液(浓度：100 ng/pL)稀释成浓度为 10、1、0.1、0.01、0.001、0.00010.00001 ng/uL 的混合液。 1.7 PCR测试 猫源性成分实时荧光 PCR 检测的反应体系：实时荧光 PCR 混合液12.5pL，正反向引物(5 umol/L)各1uL，探针(5 umol/L)0.5uL，模板 DNA 100 ng，水补足至25 pL。实时荧光 PCR 反应循环参数：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40个循环。 18S rRNA基因引物 PCR 反应体系：PCR 预混合液12.5 uL，引物(5 umol/L)各 0.5 uL，模板100 ng，反应体积为 25 uL。扩增条件为：94℃，3 min；94℃，20 s，54℃，40 s， 72 ℃，40 s，40 个循环；72 ℃，5 min。取 10 uL PCR 产物，加1 pL 10×上样缓冲液点样进行琼脂糖凝胶电泳。PCR 产物电泳检测所用的凝胶浓度为1.5%~2.0%。 2 结果与分析 2.1 真核生物特异引物 18S rRNA 引物的检测结果 18S rRNA 基因在真核生物中高度保守，18S rRNA 基因特异物物在真核生物 DNA中能有效扩增，常用于真核生物的内参照基因。用真核生物18S rRNA 特异引物扩增本试验提取的所有 DNA溶液(包括各种动物或植物材料的DNA溶液)，所有 DNA溶液均能出现137 bp 的特异扩增条带，表明所有抽提的 DNA溶液适合于 PCR测试. 2.2 猫源性成分实时荧光PCR 物种特异性检测结果 用猫源性检测引物和探针对猫肉 DNA 和其他供试动植物样品 DNA 进行检测，只在猫 DNA中出现扩增曲线，其他38种动植物材料未出现扩增曲线(图1) 2.3 猫源性成分分时荧光 PCR 灵敏度检测结果 对 10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001 ng/pL 猫DNA 进行检测，在0.0001 ng/uL 及以上浓度的猫 DNA中均出现扩增曲线(图2)。结果表明，猫源性成分检测灵敏度为 0.0001 ng/uL 猫 DNA. 图1猫源性成分分时荧光 PCR 特异性检测图谱 Fig.1Specific detection of real-time PCR for cat derived components 图2猫源性成分实时荧光 PCR 检测灵敏度图谱 Fig. 2 Sensitivity pattern of real-time PCR detection for various dilutions of cat DNA 2.4 肉制品(动物产品)中猫源性成分的检测 以猫肉粉样品添加到不含猫成分的以动物为原料的羊肉粉基质中，制备成0.01%的添加样品，以模拟动物产品中猫源性成分的检测。结果表明：该方法能检测出动物原料产品中 0.01%的猫源性成分物质(图3)。 2.5 植物性饲料(植物产品)中猫源性成分的检测 以猫肉粉样品添加到不含猫成分的以植物为原料的小麦粉基质中，制备成0.01%的添加样品，以模拟植物产品中猫源性成分的检测。结果表明：该方法能检测出植物原料产品中0.01%的猫源性成分物质(图4). 图3 肉制品中猫源性成分实时荧光 PCR 检测图谱 图4 植物性饲料中猫源性成分实时荧光 PCR 检测图谱 Fig.3 Real-time PCR detection for cat derivedcomponents in meat products Fig. 4 Real-time PCR detection for cat derivedcomponents in plant derived feed 2.6 食品和饲料中猫源性成分检测的应用 从市场上针对性收集1个猫肉、35个肉块/肉串样品，20个其他成分食品和30个饲料样品，其中地摊和饭店的肉块样品疑为猫肉样品。使用建立的检测方法对 86个市场样品进行检测，在猫肉样品、1个地摊肉样、2个广州野味饭店肉样中检出猫源性成分(表1)。结果表明：建立的检测方法能够适用于食品和饲料的猫源性成分检测。 表11市售食品和饲料中猫源性成分检测结果 Table 1 Test results of cat derived components in commercially available food and feed 样品 样品数 检测结果 猫肉 1 检出 烤肉串(地摊) 10 在1个样品中检出 肉快/肉串样品(广州野味饭店) 10 在2个样品中检出 肉快/肉串样品(上海小餐馆) 15 未检出 其他成分食品 20 未检出 进口饲料 20 未检出 国内饲料 10 未检出 3 结论与讨论 本研究建立了食品和饲料中猫源性成分的 PCR 检测方法，该检测方法具有物种特异性和灵敏度高的特点，对于打击假冒伪劣食品、饲料，保障消费者权益和身体健康，保护我国畜牧业安全和经济利益，避免国际贸易纠纷等方面具有重要意义。 目前对物种成分的鉴定，基本上是采用生物技术手段，如以蛋白质为基础的检测技术(如ELISA)和以核苷酸为基础的检测技术(如 PCR)。PCR 检测方法由于其高特异性和高灵敏度被广泛应用于加工产品(尤其是深加工产品)的检测-10]。为确保食品的真实性，防止质量欺诈，国内外学者建立了食品中原料物种成分的 PCR 检测方法[2-11]。为防止疯牛病的发生和传播，国内外学者建立了饲料中牛、羊、猪、鸡、鱼、禽、反刍动物等常见动物成分的 PCR 检测方法12-14]。然而，现有研究多侧重于牛、羊等人类常食用的动物成分，对不常食用的猫、狗等动物源性成分研究报道较少。 Martin等采用普通 PCR 方法建立了食品和饲料中猫、狗、鼠的检测方法，方法具有特异性，检测限为0.1%。普通 PCR 方法由于使用EB等毒性致癌物质，对环境和研究人员有危害；实时荧光 PCR 方法由于对环境人员安全，且加入一条荧光探针即可对检测结果进行确证，方法优于普通 PCR 方法，目前已广泛应用于分子生物学检测。本研究以猫 12S rRNA 基因为对象，建立了猫源性成分检测的实时荧光PCR方法，方法具有特异性，检测灵敏度为0.01%，高于 Martin 等1建立的猫源性成分检测方法的灵敏度，为食品和饲料中猫源性成分鉴别提供了更高的技术保障。 ( 参 考 文 献 ) ( [ 1 ] M a rtin I，Garcia T，Fajardo V，et al. Detection of cat，dog，and rat or mouse tiss u es in f oo d and animal feed usin g spec i es-specificpolymerse chain reaction[J].Journal of animal science，2007，85：2734-2739. ) ( [ 2] Miguel A Rodriguez，Teresa Gar c ia， Isabel Gonzdlez，et al. PCR identification of beef，sheep，goat，and pork in raw and heat-treatedmeat mixtures[J].J Food Prot，2004，67(1)：172-17 7 . ) ( [3]张舒亚，金丽琴，蒋剑琼，等.食品中鱼源性成分 PCR 检测方法研究[J].食品与发酵工业，2010(1)：142-145. ) ( [4]张舒亚，吕 蓉，刘月明，等.硫酸软骨素中掺假动物成分检测方法研究[J].食品工业科技，2009(1)：309-318. ) ( [5]张舒亚，李 艳，潘良文.鸡精调味料中鸡源性成分真实性鉴别研究[J].中国调味品，2007(12)：60-62. ) ( [6]郭云霞，冒海琳，张舒亚，等.鱼翅的分类及鉴别方法[J].食品工业，2011(6)：96-99. ) ( [7]郭云霞，包建强，张舒亚，等.食品中鲨鱼源性成分真实性 PCR 鉴别研究[J].食品工业科技，2011，32(10)：421-424. ) ( [8]张舒亚，谌鸿超，宋 青，等.食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光PCR 检测方法[J].食品与生物技术学报，2013，32(2)：207-211. ) ( [9]李富威，张舒亚，曾庆坤，等.乳制品中水牛乳成分的实时荧光 PCR 检测技术[J].农业生物技术学报.2012，21(2)：247-252. ) ( [10]李富威，张舒亚，任 硕，等.鳕鱼成分的分时荧光 PCR检测方法[J].中国生物工程技术杂志，2012，32(12)：80-85. ) ( [11]郭云霞，张舒亚，甚鸿超，等.SYBR Green 实时荧光 PCR 检测食品中鲨鱼源性成分真实性方法的建立[J].食品与生物技术学报， 2012，31(12)：1300-1306. ) ( [ 1 2] Dalmasso A，Fontanella E，Pi a tti P，et al. A multiplex PCR assay for the identif i cation of animal species in feedstuffs[J]. Molecular and Cellular Probes ， 2004，18：81-87. ) ( [13]张舒亚，管薇薇，刘月明，等.饲料中鱼源性成分真实性鉴别研究[J].饲料研究，2009(6)：45-48. ) ( [14]罗家琴，王加启，卜登攀，等.饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的 PCR 检测方法及其应用[J].中国农业科学2008，41(7)：2112-2119. ) 食品和饲料中猫源性成分实时荧光PCR检测方法 数据