牛奶中左旋咪唑检测方案

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ICSG 中华人民共和国国家标准 GB 29681-2013 食品安全国家标准牛奶中左旋咪唑残留量的测定高效液相色谱法 Determination of Livamisole residues in milk by High PerformanceLiquid Chromatographic method (电子版本仅供参考，以标准正式出版物为准) 2013-09-16发布 2014-01-01实施 中华人民共和国农业部 发布中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 .次 目 次.. 前 言.. 牛奶中左旋咪唑残留量的测定高效液相相谱法. 1 1范围. 1 2规范性引用文件. 1 3.原理.. 1 4试剂与材料. 1 5仪器和设备..... 2 6试料的制备与保存. 3 6.1试料的制备. 3 6.2试料的保存. 3 7测定步骤. 3 7.1提取. 3 7.2净化. 3 7.3标准曲线的制备. 3 7.4测定. 3 7.5空白试验. 4 8结果计算与表述. 4 9检测方法灵敏度、准确度、精密度.. 4 9.1灵敏度. 4 9.2准确度. .9.3精密度. 5 附录 A......... 6 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准系国内首次发布的国家标准。 牛奶中左旋咪唑残留量的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了牛奶中左旋咪唑残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。 本标准适用于牛奶中左旋咪唑残留量检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 1.1-2000 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试料中残留的左旋咪唑，用碳酸盐缓冲液和乙酸乙酯溶液提取，C18柱净化，甲醇洗脱，高效液相色谱测定，外标法定量。 4试剂与材料 以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1盐酸左旋咪唑标准品， 含量≥99.0%。 4.2甲醇 4.3无水碳酸氢钠：优级纯。 4.4碳酸钠 4.5磷酸二氢钠 4.6浓氨水 4.7二二乙胺：优级纯。 4.8乙腈 4.9磷酸 4.10盐酸 4.11 Ci8固相萃取柱：：500 mg/3 mL. 4.12 10%磷酸溶液：J：取磷酸70mL，用水溶解并稀释至1000 mL。 4.13 3 mol/L盐酸溶液：取盐酸250mL，用水溶解并稀释至1000 mL。 4.14 碳酸氢钠饱和水溶液：：取水1000 mL，加无水碳酸氢钠至不溶解为止，现用现配。 4.15 碳酸钠饱和水溶液：：取水500mL， 加碳酸钠至不溶解为止，现用现配。 4.16 碳酸盐缓冲液(约pH=9)：取碳酸氢钠饱和水溶液900 mL， 加碳酸钠饱和水溶液 100 mL， 混匀。 4.17 0.02 mol/L 磷酸二氢钠二乙胺缓冲溶液：取磷酸二氢钠2.44 g，加水850mL溶解，加二乙胺3 mL混合，用10%磷酸调pH至7.5，用水稀释至1000 mL。 4.18 1 mg/mL 左旋咪唑标准贮备液：精密称取盐酸左旋咪唑标准品10 mg，g， 于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的左旋咪唑标准贮备液。2~4℃保存，有效期3个月。 4.19 10 ug/mL左旋咪唑标准工作液：精密量取1 mg/mL左旋咪唑标准贮备液1.0 mL， 于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 ug/L的左旋咪唑标准工作液。2~4℃保存，有效期3个月。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。 5.2分析天平：感量0.00001 g. 5.3电子天平：感量0.01go 5.4均质机。 5.5冷冻高速离心机。 5.6电热恒温水浴锅。 5.7旋涡混合器。 5.8茄形瓶：50mL。 5.9离心管 5.10滤膜：0.45um. 6试料的制备与保存 6.1试料的制备 取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，混合均质。 —―取均质后的供试样品，作为供试试料。 —―取均质后的空白样品，作为空白试料。 ――取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 6.2试料的保存 -20℃以下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取试料(5+0.05)g，，于离心管中，加碳酸盐缓冲液5 mL， 加乙酸乙酯10 mL， 混匀，6000 r/min离心10 min， 取上清液于茄形瓶中，再加乙酸乙酯10 mL萃取一次，合并两次上清液，于50℃水浴旋转蒸发至干，加碳酸盐缓冲液5 mL溶解残余物，备用。 7.2净化 C8柱依次用水3 mL、甲醇3mL和碳酸盐缓冲液3mL活化，取备用液过柱，用水3mL淋洗，用甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，于50℃水浴氮气吹干，用流动相1.0 mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。 7.3标准曲线的制备 准确量取10 ug/mL左旋咪唑标准工作液适量，用流动相稀释，配制成浓度为10、20、50、100、200、400和800 ug/L的系列标准工作液，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱： C18(150 mmx4.6 mm， 粒径5um)，或相当者； 流动相： 0.02 mol/L 磷酸二氢钠二乙胺缓冲溶液+甲醇(70+30， v/v)； 流速：1mL/min； 检测波长：220nm； 进样量：50L； 柱温：30℃。 7.4.2测定法 取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中左旋咪唑响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和空白添加试样溶液的高效液相色谱图见附录A。 7.5空白试验 除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。 8 结果计算与表述 试料中左旋咪唑类的类留量 (ug/kg)：按下式计算 式中： X--供试试料中左旋咪唑残留量，ug/kg； A--试样溶液中左旋咪唑的峰面积； As标准工作液中左旋咪唑的峰面积； Cs标准工作液中左旋咪唑的浓度， ug/L； V--溶解残余物所用流动相体积， mL； m-供试试料质量， g. 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1灵敏度 本方法的检测限为 2.5 ug/kg， 定量限为 5 ug/kg。 9.2准确度 本方法在 5~20 ug/kg 添加浓度水平上的回收率为 70%~110%。 9.3精密度 本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。 附 录A (资料性附录) A3 牛奶空白添加左旋咪唑试样色谱图(20ug/kg) Ⅱ 左旋咪唑是一种广谱驱肠虫药，主要用于驱蛔虫及勾虫。目前试用于肺癌、乳腺癌手术后或急性白血病、恶化淋巴瘤化疗后作为辅助治疗。不合理的使用左旋咪唑会造成动物产品中的残留，残留的左旋咪唑对人体的主要潜在危害是致畸作用和致突变。本方法参照食品安全国家标准 GB 29681-2013，建立了牛奶中左旋咪唑残留分析的固相萃取-高效液相色谱法。