饲料中氯霉素残留量检测方案(二手分析仪器)

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一32一中国饲料2008年第4期 2008年第4期中国饲料—33<—— 超高效液相色谱(UPLC)测定饲料中氯霉素残留量 农业部饲料质量监督督验测试中心(成都) 娅 程传民 [摘要]本实验采用碱化乙酸乙酯作为提取剂，旋转蒸干提取液后溶于缓冲液中，经正经烷脱脂、Cjg固相萃取小柱净化后，采用超高效液相色谱仪(UPLC)对饲料中氯霉素的含量进行测定。结果表明：回收率高，变异系系小且检测方法快速、准确。 [关键词]超高效液相色谱；氯霉素；饲料 [中图分类号] S816.17 [文献标识码]A [文章编号]1004-3314(2008)04-0032-02 [Abstract] A method for detecting Chloramphenicol (CAP)residue in feed was established.Chloramphenicol residuewas extracted from feed with ethylacetate，followed by sample clean up with n-hexane and Cis solid-phase extraction car-tridg，and quantified by ultra performanace liquid chromaograyhy with TUV detector.The results showed that the recoveryrate was higher and the relative standard deviation was lower.This method was rapid and accurate. [Key words] UPLC；Chloramphenicol；feed GB/T 8381.9-2005中关于饲料中氯霉素检测操作方法较为复杂，容易造成实验误差。本实验运用超高效液相色谱仪(UPLC)对饲料中氯霉素含量进行测定，方法简单，不需要衍生，误差小，可以大大缩短检测时间。 材料与方法 1.1 仪器 涡旋混匀器，氮吹仪器，旋转蒸发仪，固相萃取装置，离心机，超高效液相色谱仪，紫外检测器。 1.2 试剂 水符合 GB/T 6682中一级水和三级水的规定。一般化学分析实验用三级水，高效液相色谱分析和Cg固相萃取小柱的淋洗用一级水；碱化乙酸乙酯： EtOAC：NHOH 98：2；磷酸盐缓冲液：称取8g KHPO和2gKHPO，定容 1000mL，此缓冲液 pH 值为6.0；氯霉素贮备液：准确称取25.0 mg氯霉素标准品(99.8%)，用乙腈溶解、定容至100 mL， 此贮备液浓度为 250 pg/mL；氯霉素工作液：使用时根据需要与流动相配成标准工作液；Cis固相萃取小柱：200 mg/3 mL。 1.3 样品提取 称取5g样品，置于50mL离心管中，加10 mL碱化乙酸乙酯，涡旋振荡 15 min，5000 r/min 离心 5 min，吸取上层清液置于离心管 中，以10 mL碱化乙酸乙酯重复提取，合并2次提取液。40℃旋转蒸干，以5mL磷酸盐缓冲液溶解残渣，置于10 mL离心管中，用2mL正己烷振荡脱脂，离心分层，弃去正己烷，重复脱脂1次，备用耳 样品净化 将溶液加入到C18小柱中(预先用3mL甲醇活化，用一级水2mL淋洗)，用一级水3mL淋洗，吹干，再用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，在45℃水浴中用N，吹去甲醇，残留物用1mL流动相溶解。过 0.45 p.m 滤膜，待测。 1.5 色谱条件 色谱柱：Cg2.1 mmx50 mm，1.7pm；流动相：乙腈-水(25/75，V/V)；柱温：35℃；流速：0.25 mL/min；检测器：紫外检测器，波长：280nm；进样量：5pL。 2结果与分析 2.1 同一提取体积的重复性实验及回收率比较本实验在空白样本中添加相同浓度的氯霉素标准溶液进行重复性实验，按照本方法进行提取、净化，用超高效液相色谱仪进行分析。每个样品进样5次，结果见表1。由表1可见，回收率≥89.7%，变异系数≤3.2%。 2.2 方法的线性范围和相关性 在选定的色谱 条件下，将不同浓度的标准品分别进样20pL做定量校正曲线。以进样浓度(mg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到工作曲线(见表2)。结果表明，方法在1~500 mg/mL 范围内线性相关。其检出限以 10个空白溶液检测结果的平均值加上3倍标准偏差计算为 0.20 p.g/kg。 表1 同一种提取试剂的比较 序号 添加量(mg/lg) 提取体积(ml) 测定结果(mgkg) )平均回收率(%) 变异系数(%) 10 15 93.1 32 1 10 15 926 1.9 10 15 950 95.0 2.1 4 10 15 8.97 89.7 23 10 15 939 93.9 15 表2 不同浓度的标准溶液与峰面积响应值之间的线性关系 进样浓度 进样体积 平均出峰时间 E峰面积 (mg/mL) (pL) (min) 10 20 325410 20 20 682623 50 20 3.236 1526557 100 20 3098754 200 20 6345669 500 20 14982574 y=3x10*x+101048，R=0.9997 2.3 方法的准确度和精密度实验 在不含氯霉素的同一饲料样本中，分别添加浓度5、10、20 mg/kg 的氯霉素标准溶液，每种样品提取5次进行精密度和准确度实验，结果见表3。 表3 样品准确度和精密度实验(n=5) 添加量 测定值(mp/kg) 相对偏 绝对误 变异系 (mgkg) 3 4 5 差(%) 差(%) 数(%) 5 45 46 43 44 45 3.14 054 256 10 95 93 9.4 96 95 1.48 054 121 20 19.6 193 19.2 19.4 193 124 0.74 0.78 由表3可见，样品的变异系数≤2.56%，说明重现性好，相对偏差≤3.14%，说明该法精密度高，绝对误差小于0.74%，表明该方法准确度高，因此，在有条件的情况下可按标准的偏离程序运行。 3 结论 实验证明，该法回收率高，变异系数小，检测限符合欧盟标准，是一种快速高效的测定方法。 [通讯地址：成都市，邮编：610041] (上接第31页) 表1 猪肉中青霉素类加标验证 添加水平 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 pg/kg 10 ug/kg 25 pg/kg + + + + + + + + + + 50 pg/kg + + + + + + + + + 霉素等标准品，样品测定结果均为阴性。验证了Charm Ⅱ放射免疫分析法测定猪肉中青霉素类残留的特异性符合检测要求。 2.3 最大残留限量 MRL 验证 选取阴性样品，添加青霉素G标准品，添加水平分别为10、25pug/kg 和 50 pg/kg，每个水平10份样品，测定出的cpm 值与检测限为 25 pg/kg 控制点 cpm 值930进行比较。若样品的 cpm 值>930，结果为阴性；若样品的 cpm 值<930，结果为阳性。实验结果见表1。 从表1可看出在添加水平为10 pg/kg 及空白对照样品结果为阴性，而添加水平为 25 pg/kg及 50 pg/kg 的样品结果为阳性。说明在检测限为25 p.g/kg时，此方法的灵敏度符合青霉素类检测要求。 3 结论 应用 CharmⅡ放射免疫分析方法测定猪肉样品的青霉素类药物残留，方法可靠，灵敏度高，特异性强。本方法青霉素类药物检测限分别为青霉素G 25 pg/kg、氨苄青霉素50 p.g/kg、阿莫西林50 pg/kg、双氯青霉素300 pg/kg、邻氯青霉素300pg/kg，符合中国、欧盟和美国的青霉素类最大残留限量的检测要求。且具有快速简便，在90 min内即可初筛结果，假阴性率为0%，有助于大批量样品的初筛及日常监控。但是，该检测方法的检测结果存在假阳性的可能，因此，初筛阳性的样品仍需用其他方法确证。 ( 参考文献 ) ( [1]黄晓 蓉 ，郑晶，杨芳，等.放射性受体免疫分析方法快速测定筛捡烤鳗中 霉素 残 留[].水产水殖，2003，24(4)： 1 6~18. ) ( [2] 郑晶，黄晓蓉， 林 杰，等.应用放射免疫分析方法快速筛检烤鳗中四环素 旋药物残留U].福建水产，2005，3，47~49. ) ( [3] CHARM Sciences In c .Charm II T e s t Fo r Be t a-la c tams in Tissue，Serum，and Urine- O perator’s M a nual[Z].2002.5. ) ( [通讯地址：福州市湖东路312号，邮编： 3500031 ) 作者：冯娅，科程传民， Feng Ya，小CCheng Chuanmin作者单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(成都)，成都市，610041刊名：中国饲料PKU英文刊名：CHINA FEED年，卷(期)：2008(4)被引用次数：3次 本文读者也读过(10条) 1.魏晋梅.周围.毕阳.刘彩云饲司中三种硝基呋喃类药物的超高效液相色谱同步检测方法[期刊论文]-饲料工业2007，28(10) 2.真戴华.王美玲.李拥军.朱中武. DAI Hua. WANG Mei-Ling. LI Yong-Jun. ZHU Zhong-Wu 饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC测定方法[期刊论文]-光谱实验室2006，23(6) 3.札林钦.Lin Qin 超高效液相色谱法快速检测食品中中脂树橙的含量[期刊论文]-福建分析测试2011，20(3) 4.卢艳芬.周莹.丑亚琴.王兰平. Lu Yan-fen.Zhou Ying. Chou Ya-qin. Wang Lan-ping 固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽肉中氯霉素残留量[期刊论文]-中国卫生检验杂志2008，18(1) 5.白白桦.王海波.邱月明.BAI Hua. WANG Hai-bo. QIU Yue-ming 化妆品中氯霉素的气相色谱-质谱快速分析[期刊论文]-分析试验室2007，26(7) 6.岳秀英.彭莉.高岚高效液相色谱法测定鸡蛋中氯霉素残留量[期刊论文]-四川畜牧兽医2004，31(3) 7..文刘红云.蔡海莹. LIU Hong-yun. CAI Hai-ying 饲料中氯霉素气相色谱-质谱检测方法的研究[期刊论文]-兽药与饲料添加剂2008，13(6) 8.引张英.蔡志斌.郑志伟.ZHANG Ying. CAI Zhi-bin.MANG Zhi-wei 超高效液相色谱法同时测定油炸食品中4种黄曲霉毒素[期刊论文]-实用预防医学2011，18(8) 9.迟玉明.赵晞瑛.迟玉成.郭济贤.CHI Yu-ming. ZHAO Xi-ying. CHI Yu-cheng. GUO Ji-xian 蜂王浆中抗生素残留物质氯霉素的含量测定[期刊论文]-天然产物研究与开发2006，18(3) 10.岛津国际贸易(上海)有限公司超高效液相色谱串联质谱联用法测定瘦肉精[期刊论文]-中国食品2011(10) 引证文献(3条) 1.王金丽.梁文艳.陈莉：微囊藻毒素MCLR的分离与纯化[期刊论文]北京林业大学学学2010(2) 2.李歆.李小玲高效液相色谱技术在饲料安全生生中的应用[期刊论文]畜牧与饲料科学2009(1) 3.孙会敏.田颂九高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用[期刊论文]齐鲁药事2011(1) 引用本文格式：冯娅.程传亚. Feng Ya. Cheng Chuanmin 超高效液相色谱(UPLC)测定饲料中氯霉素残留量[期刊论文]中国饲料2008(4) 数据 本实验采用碱化乙酸乙酯作为提取剂，旋转蒸干提取液后溶于缓冲液中，经正乙烷脱脂，C18固相萃取小柱净化后，采用超高效液相色谱仪（UPLC）对饲料中氯霉素的含量进行测定。结果表明：回收率高，变异系数小且检测方法快速、准确。