饲料中乙氧酰胺苯甲酯检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

宋荣 吴翠玲，安娟，薛彬 采用固相萃取技术结合高效液相色谱-荧光检测法测定饲料中的乙氧酰胺苯甲酯 乙氧酰胺苯甲酯，又名衣索巴，俗名球虫酯，是尼卡巴嗪和氨丙啉等抗球虫药的增效剂。该药品抗球虫作用及机理与磺胺药和抗菌增效剂相同，本身具有抗原虫活性，它通过干扰四氢叶酸的合成阻止裂殖体的正常发育，从而产生抗球虫作用。 2020年农业农村部公告第316号-6-2020饲料中乙氧酰胺苯甲酯的测定高效液相色谱法正式颁布。本文所述方法以此标准为基础，重点优化了前处理流程。本方法采用 AgilentBond Elut AL-N 柱对样品进行萃取和净化，并利用安捷伦专利的 Poroshell 120 SB-C18 色谱柱对目标物进行快速分析，荧光检测器进行检测，方法检测限为 0.0048 ug/g，定量限为0.016 pg/g. 该方法简化了公告标准中的前处理方法，在一定程度上节约了分析成本，提高了分析效率。对于基质更为复杂的饲料样品，仍需参考农业农村部公告第316号-6-2020所规定检测方法。 乙氧酰胺苯甲酯的分析 样品前处理及分析条件 取饲料样品5(±0.05) g，于 50 mL离心管中。根据生产实际需要，按照表1所示添加水平，向饲料样品中添加乙氧酰胺苯甲酯标准品，制备得到加标样品，用于考察方法的稳定性和准确度。 表1.各种饲料的乙氧酰胺苯甲酯添加水平 饲料 添加水平 鸡预混饲料 200 mg/kg 和500mg/kg 蛋鸡预混饲料 20 mg/kg 鸡配合饲料 0.3 mg/kg 肉鸡配合料 8.0 mg/kg 蛋鸡浓缩料 10.0mg/kg 加标后，将饲料混合均匀，静置过夜。加入20mL 乙腈萃取，涡旋混合1min，超声10 min， 5000 r/min 离心后取10mL上清液在30-40℃下氮吹近干；复溶于 5 mL 正己烷：丙酮 (v/v， 9：1)中；涡旋混合1 min，超声10 min， 5000 r/min 离心10 min，上清液经过 Bond Elut AI-N SPE 柱进行净化处理 (SPE 流程见图1)；接收洗脱液，氮吹近干后，用1mL甲醇重新定容，供LC-FLR检测，分析条件如表2所示。每个加标样品分别做三个平 行样品进行测定。 图1.饲斗中乙氧酰胺苯甲酯固相萃取净化操作流程 乙氧酰胺苯甲酯标准品，用甲醇逐级稀释配制成 0.1、0.5、、11.05.0、10.0、20.0 pg/g 的标准溶液。从低浓度到高浓度样品进行分析，所得数据制作为标准曲线。 液相色谱仪： 8.0 70 30 流速： 1mL/min 进样量： 10 pL 柱温： 30°℃ 时间： 8 min 发射波长： 350nm 激发波长： 306nm 样品前处理过程的优化 方法比对了两种不同 SPE 操作流程处理后的样品的分析结果，两种SPE 操作流程为：1，红色，目标分析物经乙腈提取后，直接浓缩至2mL， 再过 Bond Elut Al-N柱，正己烷淋洗，甲醇洗脱；2，蓝色，乙腈提取后浓缩，转换溶剂为正己烷：丙酮后，过 BondElut AI-N 柱，正己烷淋洗，甲醇洗脱。 两种不同 SPE 操作流程所得最终样品分别用 LC-FLR 和 LC-UV 检测，虽然两种方式均可以得到较好回收率的实验结果，但是用后一种方法(2，蓝色)可以保证对饲料基质更加干净的萃取，去除了保留性较强的基质干扰组分，从而在一定程度上减少了基质对仪器和色谱柱的污染。如图2和图3所示，红色线的基质干扰明显较大。 图2.鸡预混饲料，加标浓度 0.3 pg/g， HPLC-FLR检测结果 红色：乙腈提取浓缩后直接过 Bond Elut AL-N SPE 柱 蓝色：乙腈提取后浓缩转换成正己烷丙酮溶剂过 Bond Elut AL-N SPE柱 图3.鸡预混饲料，加标浓度0.3 pg/g， HPLC-UV检测结果 红色：乙腈提取浓缩后直接过 Bond Elut AL-N SPE 柱 蓝色：乙腈提取后浓缩转换成正己烷丙酮溶剂过 Bond Elut AL-N SPE 柱 色谱分析条件的优化 色谱分析采用安捷伦专利的 Poroshell 120 EC-C18色谱柱，在普通液相色谱仪上可以实现快速分析。8 min 内即可完成整个方法的运行。由图4可以看出，连续进样6针，色谱图基本完全重合，表明方法具有完美的重复性。在0.1-20.0 pg/g 范围内，仪器具有良好的线性，线性相关系数R²为0.9989，见图4。 图4.1.5 pg/g标准品6针重复测试 回收率结果 根据实际生产需要，在不同品种的饲料基质中加入合适水平的乙氧酰胺苯甲酯，均可以获得很好的回收率结果，见表3。平均回收率均在 98.0%-111.3%之间， RSD 均小于5%(n=6)，说明该方法具有很好的准确度和精密度。 表3.饲料中乙氧酰胺苯甲酯加标回收率 加标浓度 平均回收率(%) RSD(%) 鸡预混饲料200.0 pg/g (n=6) 111.3 2.01 鸡预混饲料 500.0 pg/g (n = 6) 98.0 2.18 蛋鸡浓缩饲料20.0 pg/g (n=6) 111.02 0.68 鸡配合饲料 0.3 pg/g(n=6) 106.6 4.64 肉鸡配合饲料 8.0 pg/g (n=6) 102.2 1.38 蛋鸡浓缩饲料 10.0 pg/g (n=6) 105.4 2.22 结论 本方法基于 Agilent Bond Elut AL-N SPE 柱，结合 Poroshell 120SB-C18快速色谱柱，在普通液相色谱仪上实现了对饲料中乙氧酰胺苯甲酯的含量分析。方法准确度和精密度均可达到标准要求，同时简化了前处理方法，大大提高了分析效率。该方法适用于实际生产中饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量的测定。 25 图5.标准曲线，线性范围 0.1-20.0 pg/g 消耗品 部件号 Agilent Luer 活塞 12131005 Agilent Vac Elut 20 固相萃取装置 12234103 Agilent Bond Elut AL-N固相萃取小柱1g， 6mL， 30/包 12256086 Agilent Poroshell 120 SB-C18 100×4.6 mm， 2.7 pm 685975-902 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2020 ·Agilent，中国出版Trusted AnswersHCN 乙氧酰胺苯甲酯，又名衣索巴，俗名球虫酯，是尼卡巴嗪和氨丙啉等抗球虫药的增效剂。该药品抗球虫作用及机理与磺胺药和抗菌增效剂相同，本身具有抗原虫活性，它通过干扰四氢叶酸的合成阻止裂殖体的正常发育，从而产生抗球虫作用。2020 年农业农村部公告第 316 号-6-2020 饲料中乙氧酰胺苯甲酯的测定 高效液相色谱法正式颁布。本文所述方法以此标准为基础，重点优化了前处理流程。本方法采用 Agilent Bond Elut AL-N 柱对样品进行萃取和净化，并利用安捷伦专利的 Poroshell 120 SB-C18 色谱柱对目标物进行快速分析，荧光检测器进行检测，方法检测限为 0.0048 μg/g，定量限为 0.016 μg/g。该方法简化了公告标准中的前处理方法，在一定程度上节约了分析成本，提高了分析效率。对于基质更为复杂的饲料样品，仍需参考农业农村部公告第 316 号-6-2020 所规定检测方法。