移液工作站在猪瘟阻断ELISA抗体检测中的应用

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猪瘟阻断ELISA抗体检测步骤猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。一、实验试剂1、包被抗原:杆状病毒表达的ASF VP30重组蛋白。2、酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的抗ASF VP30蛋白单抗。3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清。4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液（配制方法：  Na2CO3  0.318g；NaHCO3  0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS ) （配制方法： pH7.4 PBS  1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS) （配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA  10 g 现配现用）6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml  现配现用）7、 TMD底物溶液（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。  底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）8、终止液(2 mol/1 硫酸)（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）二、仪器设备1、酶标仪。 2、恒温孵育箱。3、洗板机或洗涤瓶。4、96孔酶标板。5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-3007、4道储液槽60ml 1个 RES-60-48、封板膜 FDT-CP309、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF三、试验程序包被酶标板用包被缓冲液将ASFV P30重组蛋白稀释至终浓度0.3μg/ml,每孔100μL包被96孔酶标板，37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次，300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。四、实验步骤（图片仅为实验模拟图）第一步： 酶标板上对照和样品的分布图,见下图。用移液工作站在每孔加人50μL,的稀释液,在A1、B1孔加人50μL阳性对照血清,在C1、D1孔加入50μL阴性对照血清,在E1、F1孔加人50μL稀释液,其余每孔加入50μL的血清样品,37℃孵育60 min。样品加样记录表12356789101112APBPCNDNECmFCmGH说明：P为阳性对照N为阴性对照Cm酶标单抗对照孔空白为待检样品孔第二步：弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300μL/孔。第三步：用稀释缓冲液将酶标P30单抗稀释至工作浓度,100μL/孔,37℃育30min。第四步：弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300μL/孔。第五步：每孔加人底物溶液,100μL/孔,室温避光作用15min。第六步：每孔中加人100μL终止液,终止反应。第七步：用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD值,计算阻断率。阻断率计算方法阳断率按式(2)~式(4)计算:BRs=100-(OD450-s X100)÷OD450-Cm ………………(2)BRNC=100-(OD450-NC X100)÷OD450-Cm  ………………(3)BRpc=100-(OD450-PCX100)÷OD450-Cm   ………………(4)式中:BRs——待检血清样品阻断率;BRNC——阴性对照血清阻断率;BRPC——阳性对照血清阻断率;OD450-s——待检血清样品OD450值;OD450-NC ——阴性对照血清OD450值;OD450-PC ——阳性对照血清OD450值;OD450-Cm——酶标单抗对照OD450值。五、试验成立条件阳性对照阻断率>70,且阴性对照阻断率<30,试验结果有效;否则,应重新进行试验。六、ELISA抗体检测结果判定在试验成立的前提下,待检样品阻断率>50,则判定为ASFV抗体阳性;待检样品阻断率<50,则判定为ASFV抗体阴性。      广州市程淇生物技术有限公司GuangzhoulCF Biotech Co.,Ltd   邮  箱:info@icfbio.com热线电话:400-168-3986        网址:www.icfbio.com公司地址:广州市花都区花港大道盛丰工业区87号4栋3楼