细胞色素C、溶菌酶、胰岛素等低蛋白质样品中含量分析检测方案(液质联用仪)

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上海通微分析技术有限公司Unimicro (Shanghai) Technologies Co.， Ltd.Application NoteAN0425-SK0038 高效微流电动液相色谱系统-质谱法在线富集蛋白质 1.背景介绍 毛细管电色谱(CEC)结合了高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的优点，保留了它们的分离机制，实现了高选择性和高效率，并具有普遍的适用性和良好的样品装载能力。因此，它有可能成为分离复杂混合物的强大工具。然而， CEC 的发展受到各种困难的限制，特别是色谱柱中气泡的形成。为解决这一问题，常用低离子强度的缓冲剂来降低焦耳热。此外，还可以在色谱柱上施加补充压力，称为高效微流电动液相色谱(eHPLC)。在 eHPLC 系统中，对色谱柱施加的压力抑制了气泡形成。可以通过旋转式进样器实现 eHPLC 中样品的定量注入。电渗流(EOF)可以与压力流方向相同，也可以与压力流方向相反，由此可以控制样品的洗脱顺序。更重要的是， eHPLC 与 HPLC相同，可以改变流动相的比例，设置溶剂梯度洗脱模式。 尽管紫外检测器通常用于 CEC，但质谱(MS)是一种强大的检测工具，特别是在生化应用过程中，可为各种样品提供高灵敏度和可靠的检测。此外，它还能够提供许多有关分析物结构和特性的信息。迄今为止， eHPLC-MS 已成功应用于肽、麦角菌粗提物和对映体的分析。然而，检测灵敏度相对较低仍然是最严重的问题之一，特别是对于蛋白质的分析。因此，有必要开发一种蛋白质的在线富集技术。 我们以细胞色素C、溶菌酶、胰岛素为检测样品，开发了一种可用于低浓度蛋白质样品的分析方法。并且与常规进样相比，此方法检测灵敏度有了明显的提高。 2.测试条件 仪器： TriSep @-3000高效微流电动液相色谱系统，配备 ESI-MS 检测器 色谱柱： 通微 EP-100-20/30-3-C18 3.测试结果 图1三种蛋白质标准品的 eHPLC-ESI-MS分离图谱 注： a在线富集；b未在线富集； 1细胞色素C；2溶菌酶；3胰岛素 表1未富集和在线富集后蛋白质检测的重复性和检出限 Conventional injection Cytochrome c Lysozyme Insulin Reproducibility Retention time <1.2 <1.7 <0.9 (RSD%) Peak area <4.8 <3.2 <2.1 LOD (S/N=3) Absolute concentration 2.0x10-11 mol 2.2×10-11mol 34.6×10-11mol On-line concentration Reproducibility Retention time <3.5 <2.3 <1.0 (RSD%) Peak area <7.7 <8.4 <9.6 LOD (S/N=3) Absolute concentration 9.0×10-13 mol 4.6×10-13 mol 2.5×10-13 mol 4.结论 采用 TriSep @-3000 高效微流电动液相色谱系统，配备 ESI-MS 检测器，通微 EP-100-20/30-3- C18色过柱，通过在线富集，可以实现对低浓度蛋白质的检测。蛋白质标准品的检出限可提高20-100倍，此方法已成功应用于浓度为 20 mg/mL的蛋白质的分析。结果表明我们提出的方法可能在蛋白质组学研究中发挥重要作用。 5.配置列表 仪器配置 TriSep @-3000 高效微流电动液相色谱系统(配二元梯度泵、柱温箱、ESI-MS检测器、高压电源、自动进样器、微流控、控制器) Clarity Lite 色谱工作站 www.unimicrotech.com.cn TEL：E-mail：info@unimicrotech.com.cn 毛细管电色谱（CEC）结合了高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）的优点，保留了它们的分离机制，实现了高选择性和高效率，并具有普遍的适用性和良好的样品装载能力。因此，它有可能成为分离复杂混合物的强大工具。 然而，CEC的发展受到各种困难的限制，特别是色谱柱中气泡的形成。为解决这一问题，常用低离子强度的缓冲剂来降低焦耳热。此外，还可以在色谱柱上施加补充压力，称为高效微流电动液相色谱（eHPLC）。在eHPLC系统中，对色谱柱施加的压力抑制了气泡形成。可以通过旋转式进样器实现eHPLC中样品的定量注入。电渗流（EOF）可以与压力流方向相同，也可以与压力流方向相反，由此可以控制样品的洗脱顺序。更重要的是，eHPLC与HPLC相同，可以改变流动相的比例，设置溶剂梯度洗脱模式。尽管紫外检测器通常用于CEC，但质谱（MS）是一种强大的检测工具，特别是在生化应用过程中，可为各种样品提供高灵敏度和可靠的检测。此外，它还能够提供许多有关分析物结构和特性的信息。迄今为止，eHPLC-MS已成功应用于肽、麦角菌粗提物和对映体的分析。然而，检测灵敏度相对较低仍然是最严重的问题之一，特别是对于蛋白质的分析。因此，有必要开发一种蛋白质的在线富集技术。我们以细胞色素C、溶菌酶、胰岛素为检测样品，开发了一种可用于低浓度蛋白质样品的分析方法。并且与常规进样相比，此方法检测灵敏度有了明显的提高。