蛋白中分离组学检测方案(液相色谱仪)

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上海通微分析技术有限公司Unimicro (Shanghai)Technologies Co.， Ltd. Halo BioClass Protein 系列蛋白分离专用柱-助力组学分析 1.背景介绍 Halo 新型核壳填料色谱柱技术： Halo色谱柱采用创新性熔融核技术制备色谱柱填料，把全多孔硅胶层熔合在实心球型硅胶材料上制备而得，采用该技术制备的填料也被称作表面多孔颗粒以及核壳型色谱填料，独特的核壳结构(实心球体外面包裹个几十个纳米的壳层有效固定相)使得制备出的 UPLC 与 HPLC 色谱柱具有超快速分离、高分离度、高柱效等特点。 核壳结构填料的切面电镜照片 除常规小分子样品分析外， Halo 色谱柱针对生物大分子样品的分离(如多肽、蛋白、聚糖)，推出 Halo BioClass 系列专用柱，其中有针对多肽分离的 Peptide 专用柱，有针对蛋白分离的 Protein 专用柱，也有针对聚糖分离的 Glycan 专用柱。其中，适于蛋白质分离的 Halo BioClass Protein 系列色谱柱，可有效实现小分子蛋白和大分子蛋白的快速分离，获得高的分离度和峰容量。 选型指导 待测样品分子量范围 孔径A 应用领域 粒径 所属类型 小分子(<5000Da) 90 小分子 2，2.7，5 HALO 小分子(<20kDa) 90 糖 2.7 HALO BIOCLASS 中等大小分子(100Da50kDa) 1000 2.7 Halo BioClass Protein 可提供 2.7um 和 3.4um两种不同粒径的填料，适用于 UPLC，HPLC， LC-MS 等多种系统。填料类型有适于蛋白质分离的 Halo Protein ES-C18 和Halo Protein C4 等填料，可满足大部分的蛋白分离。 键合相 对应USP 粒径um 孔径 含碳量(%) 比表面积(m²/g) 适用pH下限及温度下限 适用pH上限及温度上限 是否封尾 C4 L26 2.73.4 1000400 0.60.4 2215 2/90°C 9/40°C 是 ES-C18 L1 2.73.4 1000400 1.41.0 2215 1/90°C 8/40°C 是 HALO 1000A C4 固定相是丁烷基键合在孔径为1000A的熔融核材料上，特殊的设计使其能够超快速、高分辨率分离单克隆抗体、抗体-药物偶联物、抗体片段和分子量高达500 kDa 的大分子蛋白。此外，由于键合相受空间位阻保护，使得 Protein C4 柱在低pH 值、高温条件下分离效果稳定、具有良好的传质动力学性能、可以兼容 HPLC、UHPLC 和 LC-MS 等。 HALO 1000A ES-C18固定相是十八烷基键合在孔径为1000A的熔融核材料上，特殊的设计使其能够超快速、高分辨率分离单克隆抗体、抗体-药物偶联物、抗体片段和分子量高达500 kDa 的蛋白质物质。此外，其可以耐受90℃的高温、可以洗脱巨大的蛋白质分子并且具有良好峰形、可以兼容HPLC、UHPLC 和 LC-MS等。 HALO 400A C4 固定相是丁烷基键合在孔径为400A的熔融核材料上，特殊的设计使其能够超快速、高分辨率分离单克隆抗体、蛋白和分子量小于 500 kDa 的多肽。此外，其可以耐受90℃的高温、可以洗脱大分子蛋白并且可获得良好峰形、可以兼容 HPLC、UHPLC 和 LC-MS 等。 HALO 400 A ES-C18 HALO 400A ES C18固定相是十八烷基键合在孔径为400A的熔融核材料上，特殊的设计使其能够超快速、高分辨率分离单克隆抗体、蛋白和分子量小于500 kDa 的多肽。 此外，其可以耐受90℃的高温、可以洗脱大分子蛋白并且可获得良好峰形、可以兼容HPLC、UHPLC和 LC-MS等。 2.应用实例 1) HALO Protein C4 进行大蛋白质分离 测试条件： 色谱柱： HALO 400 A C4，3.4 um， 2.1 x100 mm货号：93412-614 流动相： A=0.1%TFA水溶液， B=0.09%TFA 乙腈溶液，梯度： 35-55%B in 30 min流速：0.45mL/min温度：80℃检测器： UV 215nm 进样量：1.0uL 在80℃下使用 HALO400AProtein C4高效分离变性收缩蛋白(纯化的兔骨骼肌中的整个肌球蛋白)的轻链和重链。 2) HALO Protein C4色谱柱高效分离单克隆抗体 IgG1 测试条件： 色谱柱： HALO 400 A C4， 3.4 um， 2.1 x 100 mm货号：93412-614 流动相： A=20 mmol/L 的甲酸安水溶液(含甲酸0.5%)， B=乙腈-异丙醇-流动相 A=45： 45： 10，梯度：29%32%B in 20 min 温度：80℃ 检测器： UV280 nm， MS检测器(M/Z范围：500-2000m/z) 进样量：2pL(样品浓度 2pg/pL) 样品溶剂：0.25%(v/v)甲酸水溶液 HALO Protein C4 色谱柱分离单克隆抗体IgG1 使用 HALO 400A Protein C4色谱柱，在还原和烷基化的单克隆抗体(IgG1)样品的轻链和重链变体之间获得了很高的分离度。 3) HALO Protein C4色谱柱高分辨率分离 IgG2 测试条件： 色谱柱： HALO 100A C4， 2.7 um， 2.1 x 150 mm货号：92712-714 流动相：A=水-乙腈-正丙醇(88：10：2)含0.1%DFA， B=正丙醇-乙腈-水(70：20：10)含0.1%二丙胺， 梯度：14%24%B in 20 min 流速： 0.2mL/min 温度：80℃ 检测器： UV280 nm， PDA 进样量：2pL(样品浓度 2pg/pL) 传统300A孔径的 C4 与 Halo 1000A Protein C4 分离 IgG2效果对比 样品峰：1.IgG2-B， 2.IgG2-B， 2b. IgG2-B 3. IgG2-A/B， 4.IgG2-A/B， 5. IgG2-A， 6.IgG2-A* √ 与传统300A孔径的 C4色谱柱相比，核壳型 HALO 1000A孔径的 C4 色谱柱可有效改善样品与固定相作用，大分子蛋白也可自由出入，从而大大改善了对大分子蛋白的分辨度 4)相比传统全多孔填料，核壳型 Halo Protein 蛋白专用柱具有更高的柱效和峰容量 测试条件： 色谱柱： HALO 1000 AES-C18， 2.7 um， 2.1 x150 mm货号：92712-702 常规 C18，2.7 um， 2.1 x 150 mm 流动相：A=水/0.1%TFA， B=乙腈/0.1%TFA，梯度： 36%—44%B in16 min流速：0.4 mL/min 温度：60℃ 检测器： UV280nm 进量：2pL(样品浓度 2ug/pL) 相比传统全多孔填料，核壳型 Halo Protein 蛋白专用柱具有更高的柱效和峰容量 √ 与传统300A 孔径的 C18色谱柱相比，核壳型 HALO 1000A ES-C18在进行蛋白分离时，可获得更高的柱效和峰容量。 5) 核壳型 Halo 400 A ES-C18 3.4 um 填料色谱柱与传统全多孔300A孔径3 um粒径填料色谱柱分离蛋白效果对比 测试条件： 色谱柱： HALO400 AES-C18， 3.4 um货号： ES-C18：93414-602 流动相：A：水(0.1%TFA)， B=乙腈(0.1%TFA)，梯度：：23%--85%B in 1 min 流速：3.0mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215 nm 进样量：5pL 样品峰：1.核糖核酸酶A.((13.7kDa)，2.细胞色素C(12.4kDa)，3.溶菌酶(14.3kDa)，4.o-乳清蛋白-14.2kDa， 5.过氧化氢酶(总计250kDa， 4每个约60 kDa 的四聚体) √ 与传统全多孔300 A孔径3 um粒径填料色谱柱相比，使用核壳型 Halo 400 A ES-C18 蛋白分离专用柱可有效改善峰型，获得更高的柱效，更好的分离效果。 6) Halo Protein 1000 A C4 蛋白分离专用柱分离曲妥珠单克隆抗体 测试条件： 色谱柱： HALO 1000 A C4， 2.7 um， 2.1x 100 mm货号：92712-614 流动相： A：水(0.1%TFA)， B=乙腈：水=80：20(含0.085%TFA)，梯度：：40%-47.5% B in 12 min 流速：0.4mL/min 温度：80℃ 压力：210bar 检测器：UV280nm 进样量：2.0uL 样品溶剂：70/30=水/乙腈 曲妥珠单抗(MW一148 kDa) 是用于治疗乳腺癌的单克隆抗体药物。如上图所示，使用 HALO 1000 A C4色谱柱可有效实现曲妥珠单抗及其变体的有效分离。 HALO1000A C4 蛋白分离专用柱可在高温下实现生物大分子样品的高效分离。 7)LC-MS结合 Halo Protein 1000 A C4 分离检测曲妥珠单克隆抗体 测试条件： 色谱柱： HALO 100 A C4， 2.7 um， 2.1 x 150 mm 货号：92712-714 流动相： A： 10 mmol/L DFA水溶液，B：水/乙腈(10/90)含10 mmol/L DFA，梯度：32%42% B in 10min 流速：0.35mL/min 温度：80C 检测器参数：280nm(UV) 质谱参数：扫描范围为1800至4000m/z. 进样羊：1.0pL(样品浓度 2mg/ml) 样品溶剂：水/乙腈(70/30)含0.1%DFA √ 使用 HALO1000A C4 蛋白分离专用柱，借助 LC-MS分析方法实现了曲妥珠单抗的有效分析：糖基化和酶解去糖基化。在糖基化和去糖基化的单抗中，即使很小的变异结构也可以被分离识别到，从而表明了该单抗多肽结构存在结构变异。治疗性单抗的糖基化谱图是一个非常重要的参数，在单抗的整个生产过程中需要严格监控。分析去糖基化单抗的 MS图谱，可有效确认该单抗的一致性和完整性。 8)在高温低Ph 条件下， Halo Protein 1000 AES-C18 分离曲妥珠单抗显示出很好的重现性效果 测试条件： 色谱柱： HALO 1000 A ES-C18， 2.7 um， 2.1 x 50 mm货号：92712-402 流动相：A：水(0.1%TFA)，B：乙腈(0.1%TFA)，梯度：：332%—38% B in 4 min 流速：0.4mL/min 温度：80℃ 检测器： UV 280nm 进样量：1.2pL 样品溶剂：水 反压：81bar √ 曲妥珠单抗(MW一148kDa)是用于治疗乳腺癌的单克隆抗体药物。使用 HALO1000A ES-C18 色谱柱进行了500次曲妥珠单抗的重复进样分析，结果显示 HALO1000A ES-C18色谱柱表现出了很好的重复性效果。由于键合相受空间位阻保护，使得 HALO1000A ES-C18柱在低 pH 值、高温条件下分离效果也很稳定。 9)不同柱温对 HALO Protein 400 A C4色谱柱分离蛋白效果的影响 测试条件： 色谱柱： HALO 400 A C4， 3.4 um， 2.1 x 100 mm货号：93412-614 流动相：A：水(0.1%TFA)，B： 乙腈(0.1%TFA)，梯度：28%—58%B in 10 min 流速：0.45mL/min 温度：30、60、90℃ 检测器： UV215nm 进样量：2.0puL 样品溶剂：流动相A 样品峰：1.溶菌酶(14.3kDa)，2.牛血清白蛋白(66.4kDa)，3.α-胰凝乳蛋白酶原A(25.0kDa)4.烯醇化酶(46.7kDa)，5.卵清蛋白(44.0kDa) √ 由不同柱温下 HALO 400 A C4分离蛋白的效果可见，高温下 HALO 400 A C4 也可获得高柱效、高峰容量以及高温稳定性。所以， HALO 400 A C4 色谱柱具有很好的高温稳定性。 10)针对不同分子量的多肽和蛋白，选择合适孔径填料的色谱柱对于改善峰型获得好的分离效果非常重要 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 2.7 um， 4.6x100mm 货号：92124-602 HALO 400 AES-C18，3.4 um， 4.6x 100 mm 货号：93414-602 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈(0.1%TFA)， 梯度： 23%—50%B in 15 min 流速：1.5mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量：5pL 样品溶剂：流动相A 11)相比传统全多孔C4填料，核壳型填料 HALO 400AC4 具有更好的分离效果 测试条件： 色谱柱： 1)HALO 400 A C4，3.4 um， 2.1x 100 mm货号：93412-614 2)全多孔 C4， 5 um， 2.1 x 100 mm 流动相：A：水(0.1%TFA)，B： 乙腈(0.1%TFA)，梯度：25%-52% B in 10 min流速：0.5mL/min 温度：60℃ 检测器：UV215nm 进样量：1.0pL 样品溶剂：流动相 A 样品峰：1.核糖核酸酶A(13.7kDa)，2.细胞色素C (12.4kDa)，3.溶菌酶(14.3kDa)，4.全运铁蛋白(77 kDa)，5.肌红蛋白(17kDa)，6.过氧化氢酶(每个约60 kDa 的四聚体)，7.烯醇酶(46.7kDa) √ 与传统的全多孔 C4 填料色谱柱相比，使用 HALO 400AC4 色谱柱可获得更窄的峰型、更高响应的色谱峰。此外， HALO400AC4色谱柱可有效改善全运铁蛋白、载脂蛋白，过氧化氢酶以及烯醇酶的回收率。 12) HALO 1000A ES-C18分析蛋白质 测试条件： 色谱柱： HALO 1000 A ES-C18， 2.7 pm， 2.1 x150 mm 货号：92712-702 流动相：A：水(0.1%TFA)，B：乙/水(80/20)(含 0.085%TFA)，梯度：27%60%B in 15 min流速：0.4mL/min 温度：60℃ 检测器： UV 280nm 进样量： 2.0uL 样品溶剂：流动相A 样品峰：1.核糖核酸酶A (13.7 kDa)，2.溶菌酶(14.3 kDa)， 3. SigmaMAb (一150 kDa)， 4.0-乳清蛋白(14.2kDa)， 5.烯醇酶(46.0kDa单体) HALO 1000A ES-C18色谱柱上可高效分离宽分子量范围的混合蛋白样品。1000A大孔径让生物大分子样品的分离也可获得漂亮的峰型和高分辨率的分离效果。 13) HALO 400A C4 色谱柱分离检测 IgG2-B单克隆抗体 测试条件： 色谱柱：：HALO 400 A C4，3.4 um， 2.1 x 100 mm 货号：93412-614 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈/水(80/20) (含0.1%TFA)，梯度： 33%40%B in 10 min流速：0.25 mL/min 温度：80℃ 检测器： UV 280nm 进样量： 1.0pL 样品峰：1.to，2.轻链(~25kDa)，3.重链(~50kDa) 核壳型 HALO 400A C4， 3.4um色谱柱可用于分离分子量达500 kDa 的大分子蛋白。上图所示为 HALO 400A C4， 3.4um色谱柱用于分离 IgG2-B的轻链和重链蛋白。另外，特殊的空间位阻保护，使得 HALO 400A C4 色谱柱具有很好的高温稳定性。 14)流动相添加剂对单抗分离峰型的影响 测试条件： 色谱柱：1) HALO 1000 A C4， 2.7 um， 2.1x 150 mm货号：92712-714 流动相：A：水(0.1%DA， FA 或 TFA)， B：乙腈/水(80/20)(0.1%DA，FA或 TFA)，梯度：35%-47.5% B in 12 min 流速：0.4 mL/min 温度：80℃ 检测器： UV280nm 进样量：2.0pL 样品溶剂：30/70=乙腈/水 √ 曲妥珠单抗(一148kDa)是用于治疗乳腺癌的单克隆抗体(mAb)。 TFA和DFA 可以替代甲酸用作流动相添加剂，以便获得更窄、更对称的峰型，以及适当调整保留时间及改善异构体的分离效果。 www.unimicrotech.com.cn TEL：E-mail：info@unimicrotech.comcn Halo 新型核壳填料色谱柱技术：Halo色谱柱采用创新性熔融核技术制备色谱柱填料，把全多孔硅胶层熔合在实心球型硅胶材料上制备而得，采用该技术制备的填料也被称作表面多孔颗粒以及核壳型色谱填料，独特的核壳结构（实心球体外面包裹个几十个纳米的壳层有效固定相）使得制备出的UPLC与HPLC色谱柱具有超快速分离、高分离度、高柱效等特点。