化学药中肽制剂依降钙素检测方案

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日立全自动氨基酸分析仪对肽制剂依降钙素的检测 依降钙素别名益钙宁，由包含L-2-氨基辛二酸在内的31个氨基酸构成，是以提高降钙素的稳定性为目的而设计的合成多肽(分子量3363.77)，主要应用于高钙血症、骨质疏松等骨科疾病的治疗。 氨基酸组成鉴别是此类肽制剂的一种品质评价方法。在此我在使用 L-8900型日立高新全自动氨基酸分析仪，，以日本药典规定的分析方法(使用3 um填充剂的色谱柱)得到了依降钙素的氨基酸组成。本次试验所用依降钙素为市售制剂。 首先来看一下依降钙素的结构式： HSer-Asn-Leu-Ser-Thr Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-GIn-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2C148H244N42047=3363.77 【依降钙素的结构式】 m标准样品测定例 首先对标准样品进行测定，分析条件如下： <标准分析法测定条件> 分析柱 反应液 #2620M 4.5mml.D. X 80 mm ： Ninhydrin coloring solution kit for HITACHI除氨柱 #2650L 4.6mm1.D. x 40 mm 反应液流速 ：0.2 mL/min流动相 ：按照药典规定的组成配制 反应温度 ：130°C(4种溶液) 检测波长 ： VIS 440 nm.570 nm： 0.19 mL/min 流速 进样量 ：10pL柱温 ： 50-65°C 标准样品谱图： 【14种氨基酸标准溶液的测定例(各2nmol/10 uL)】 分析结果： 色谱柱的选择项目 规定内容 测定结果 14种氨基酸的洗脱顺序 依次为大冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、氨酸、甘氨酸、丙氨酸，缬氨酸，2-氨基辛二酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸 如左侧所示 峰的分离 完全分离(分分度1.5以上) 分离度1.61~-13.06 上述结果说明，我们得到了能够满足色谱柱选择要求的结果。另外，虽然药典中没有记载，但是峰面积的相对标准偏差(n=3)为0.02~1.33%，得到了良好的重现性。 ■依降钙素测定例(组成氨基酸的鉴别) 接下来对依降钙素实际样品中氨基酸的组成进行测定鉴别。 样品前处理： <样品前处理(水解)> 样品1mg 丨←苯酚盐酸溶液(*)1mL脱气 加热：1110℃、24hr 1 真空干燥 1以1mL， 0.02 mol/L的盐酸溶解 过滤 Pore Size 0.2 um 氨基酸分析样品(10uL) (*)苯酚盐酸溶液：将0.2g苯酚溶解于10mL，， 6 mol/L 的盐酸溶液中 分析谱图： 【依降钙素测定例】 测定结果： 成分名 规定值 (相对于Ala的摩尔比) 测定结果 天冬氨酸 (Asp) 17~22 2.0 苏氨酸(Thr) 3.5~4.2 3.9 丝氨酸(Ser) 2.4~~3.0 2.7 谷氨酸(Glu) 2.7~3.2 3.0 甘氨酸 (Gly) 2.7~3.2 3.1 丙氨酸(Ala) 定为1 定为1 缬氨酸(Val) 1.6~2.2 2.1 2-氨基辛二酸 0.8~1.2 1.1 亮氨酸(Leu) 4.5~5.2 5.0 酪氨酸(Tyr) 0.7~1.2 1.1 赖氨酸(Lys) 1.7~~2.2 2.0 组氨酸(His) 0.8~1.2 1.0 精氨酸(Arg) 0.7~1.2 1.0 脯氨酸(Pro) 1.7~2.2 1.9 从表中可以看出：其他各氨基酸相对于丙氨酸(Ala)的摩尔比均在规定范围内，得到了良好的结果。 关于日立全自动氨基酸分析仪，请参考： http：//www.instrument.com.cn/netshow/SH102446/C138114.htm