月饼中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸检测方案(毛细管柱)

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4077·北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923现代预防医学2015年第42卷第22期Modern Preventive Medicine， 2015， Vol.42， NO.22 营养与食品卫生· 毛细管柱气相色谱法同时测定月饼中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸 刘沛明 广西合浦县疾病预防控制中心检验科，广西北海536100 摘要：目的 建立毛细管柱气相色谱法同时测定月饼中中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸的分析方法。方法 样品经石油醚去除脂肪，乙醚提取；丙酮溶解定容，经毛细管柱(BP-21)分离后，用气相色谱-火焰离子化检测器(FID) 采用标准曲线法对4种防腐剂进行定量分析。结果 4种防腐剂在 BP-21毛细管柱上完全分离，线性方程相关系数r>0.999，检出限0.67 mg/kg~0.79 mg/kg。在5个加标浓度水平下，回收率为91.2%~96.0%，相对标准偏差(n=6)为1.6%~2.9%。结论该方法前处理简单、结果准确，能够快速、准确地检测月饼中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸。 关键词：苯甲酸；山梨酸；丙酸钙；脱氢乙酸；气相色谱法 中图分类号：R155.3 文献标志码：A 文章编号：1003-8507(2015)22-4077-04 Simultaneous determination of benzoic acid， sorbic acid， calciumpropionate，and dehydroacetic acid in moon cakesby capillary column gas chromatography LIU Pei-ming Hepu Center for Disease Control and Prevention， Beihai， Guangxi 536100， China Abstract： Objective The study was conducted to establish a capillary column gas chromatography-based analytical method forsimultaneous detection of benzoic acid， sorbic acid， calcium propionate， and dehydroacetic acid in moon cakes. Methods Fat wasremoved from the samples by petroleum ether and extracted by diethyl ether. The extracts were dissolved in acetone to a constantvolume and separated through a capillary column (BP-21)， followed by gas chromatography-flame ionization detection (FID). Thefour preservatives were then quantitatively analyzed by using the standard curve method. Results The 4 preservatives werecompletely separated through the BP-21 capillary column， with the correlation coefficient r of the linear equation being >0.999 andthe detection limit being 0.67 mg/kg-0.79 mg/kg. Under 5 internal standard concentrations， the recovery rate was 91.2%-96.0%and the relative standard deviation (n=6) was 1.6%-2.9%. Conclusion The method is with simple pretreatment procedure andproduces fast and accurate detection results of benzoic acid， sorbic acid， calcium propionate， and dehydroacetic acid in moon cakes. Keywords： Benzoic acid； Sorbic acid； Calcium propionate； Dehydroacetic acid； Gas chromatography 防腐剂是对食品中微生物的生长繁殖起到抑制作用的一类食品添加剂，但是过多的添加会对人体产生一定的危害。所以其在食品中的添加必须在《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定的范围内按规定限量使用。在一般的糕点中，只需要检测苯甲酸，山梨酸和丙酸钙，而在月饼中，则必需增加检测脱氢乙酸。 目前，国内外对防腐剂的检测主要有气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱法、气相色谱一质谱法等。国标 GB/T 5009-2003中对于这几种防腐剂的检测主要是使用填充柱气相色谱法气相色谱法。不同防腐剂有不同的检测方法，前处理方法也各不一样，在处理糖分、脂肪和蛋白含量比较 高的样品时，提取过程比较容易出现乳化现象，降低了样品的提取和加标回收的效果；而且填充柱的分离效能和分析速度都低于毛细管柱3-5]。2014年中秋前，受县食品药品监督管理局的委托，对县域内生产的月饼进行监督检测；为了加快中秋节期间月饼检验检测的质量和速度，提升食品质量监督检验能力，加强中秋期间月饼的监督管理，规范食品生产秩序，建立了一套简单、快速、适合月饼等复杂基质食品的前处理以及用毛细管柱代替填充柱的气相色谱检测方法。本方法研究建立采用石油醚提取，去除样品脂肪，再用盐酸酸化样品，乙醚提取，浓缩后丙酮定容，毛细管柱分离的样品测试方法。实验证明该方法简单快捷，试剂成本低，前处理时间短，检测结果精密度好，回收率高，结果满足检测要求。 联系人：水先生.电话：18911849923 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器 日本岛津气相色谱仪 GC-2014，配自动进样器和 FID 检测器。 1.1.2 试剂及试剂 (1)氯化钠(批号：140822)、盐酸(批号：140626)、无水硫酸钠(批号：131119)均为分析纯，购于汕头市西陇化工有限公司；丙酮(批号：130821)为色谱纯，购于汕头市西陇化工有限公司。 (2)标准物质：山梨酸(标准批号：BW3543)、苯甲酸(标准批号：BW3543)、丙酸钙(标准批批：GBW(E) 100078)、脱氢乙酸(标准批号：BW4067)，均购自国家标准物质中心。 (3)氯化钠酸性溶液 (40 g/L) (4)无水硫酸钠 1.2 标准溶液的配制 按国标 GB/T 5009-2003中相关标准配制 1.3 色谱条件 色谱柱为 BP-21石英毛细管柱(30mx0.32 mmx0.25 pm)， 载气：高纯氮气(纯度≥99.999%)；进样方式：分流进样(分流比=10)；恒流模式：载气流速为2.0 ml/min；氢气流速：30ml/min，空气流速：400ml/min；进样口温度：200℃，检测器温度：250℃，柱温采用程序升温：始温50℃，保持2 min， 以 30℃/min 升至170℃，再以20℃/min 升至220℃，保持5 min 后运行220℃，5min。 1.4 样品的制备及前处理 由于月饼样品大多都是高脂高糖高蛋白的样品，不易提取而造成毛细管色谱柱的污染，降低检测的精密度和准确度。所以本方法先去除脂肪，然后再提取。称取2.5g(精确到0.01g)样品于100 ml 具塞量筒中，用150 ml 石油醚分3提取次，振摇后静置分层，弃去石油醚，然后在抽风柜水浴中搅拌挥干石油醚，再加加1ml浓度为6 mol/L 的盐酸溶液， 25 ml 乙醚，振摇提取2min， 静止分层，将上清液转移至另一具塞比色管中。再用乙醚重复提取1次，合并提取液。用5ml酸性氯化钠溶液(40g/L) 洗涤，静置分层后弃去氯化钠层溶液。再将乙醚提取液经过预先放置了经烘烤干燥的无水硫酸钠的漏斗中过滤，再用少量乙醚冲洗无水硫酸钠，合并乙醚过滤液，分数次置于10ml容量瓶中，减压浓缩至干，用5 ml 丙酮溶解残渣，待上机测定。 2 结果与讨论 2.1 色谱柱的选择 2.1.1 不同极性色谱柱的筛选 这4种酸都是有机酸，属于极性物质。根据极性相溶的原理，为了得到良好分离效果的色谱柱，在非极性柱 DB-1、HP-100，弱极性柱 DB-5、RSL-120，中极性柱 BP-10、DB-17、DB-225和极性柱BP-21、HP-20M、LZP-930 中进行筛选比较后，分别选择长度、内径、膜厚度均为30 mx0.32 mmx0.25 um 的弱极性柱DB-5、中极性柱 DB-17 及极性柱 BP-21进行了实验测定分析比较。 2.1.2 色谱柱的实验测定选择 根据实验分析色谱图可以看到：在弱极性柱DB-5的色谱图中，丙酸钙的色谱峰附近杂质峰较多，与基线还没有完全的实现分离；而山梨酸和苯甲酸色谱峰的峰形对称性都不是很好、比较差，而且都有不同程程的展宽，达不到良好的分离展开效果。中极性柱 DB-17虽然极性略强于DB-5，但其分离效果跟 DB-5基本上差不多，也是存在着基线分离不完全，色谱峰峰形对称性差且有展宽的问题。而在极性柱 BP-21 的色谱图(见图1)上可以看到，4种防腐剂色谱峰的分离效果都非常好。丙酸钙的的色谱峰实现了基线分离、附近的杂质峰也明显减少，山梨酸和苯甲酸的色谱峰比较对称、峰形也基本上没有展宽。这也正是极性相似相容原理的体现；所以，在实验中选择了极性的 BP-21 色谱柱来进行分析测定。 图1 BP-21色谱柱峰形的图谱 2.2 样品前处理 2.2.1 国标中样品前处理 在国标中，山梨酸和苯甲酸的样品都是经盐酸酸化后用乙醚提取定容后备用。丙酸钙则是均匀化处理的样品加入磷酸溶液进行酸化和硅油，经水蒸汽蒸馏后取定量蒸馏液加入甲酸定容后待测。脱氧乙酸的前处理则是样品经氯化钠溶液和硫酸酸化后，以乙醚提取后，丙酮定容后测定。这3种前处理方法都不一样，如果都分开提取测定，则比较费时费试剂。 2.2.2 本实验样品前处理这4种防腐剂都属于极性的有机酸，极性相似；为了探索一种能同时测定四种防腐剂样品的前处理方法，根据极性相似相溶的原理，本方法试验了一种新的样品前处理方法；即样品先经石油醚提取去除脂肪后，经过盐酸酸化，使4种防腐剂的化合物转化为相应的酸后，再用乙醚提取，提取液经过无水硫酸钠脱水后水浴挥干乙 网址：：WwW.yuweichina.com邮箱water1102@163.com 醚，用丙酮溶解残渣待测。根据以上测定的线性范围和检出限，样品加标回收率和精密度测定结果显示，此种方法前处理样品的测定结果准确可靠，符合痕量分析的要求。 在1.3色谱分析条件下，月饼测定的标准色谱图 (100 mg/L)、月饼空白样品及空白样品加标(100mg/kg) 的色谱图见图2。 2.3 线性范围和检出限 配制浓度分别为(5.0mg/L、10.0mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100 mg/L、200mg/L、500mg/L)的苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸按1.3中色谱条件进行测定，以各添加剂的浓度(C)与峰面积(A)来绘制标准曲线。具体如表1所示，在 5.0 mg/L~500 mg/L浓度的范围内，4种添加剂的相关系数分别为0.99975、0.99981、0.99989、0.99976，都在0.999 以上，呈现了良好的线性关系。能准确定量。按信噪比 S/N=3计算检出限的结果分别为 0.76 mg/kg、0.69、0.67、0.79mg/kg 2.4 加标回收试验 在样品中分别添加4种防腐剂的标准溶液，使其添加浓度分别为 10.0 mg/kg， 30.0mg/kg， 50.0 mg/kg， 70.0 mg/kg， 100.0mg/kg；测定方法的准确度与精密度，每个浓度水平做6个平行测定，加标试样经提取、稀释、定容、GC-FID检测分析后，计算4种防腐剂的平均回收率及相对标准偏差 (RSD)，具体数据见表2。从表2可以看出，添加浓度分别为 10.0 mg/kg， 30.0 mg/kg， 50.0 mg/kg，70.0 mg/kg， 100.0 mg/kg 试样中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸的回收率分别为92.8%~94.6%，91.5%~96.0%，91.2%~95.3%，91.8%~94.3%；相对标准偏差分别1.9%~2.8%，1.8%~2.7%，1.6%~2.9%，1.8%~2.6%；回收率均在90%~100%，相对标准偏差均小于3%，回收率符合痕量分析要求。说明该方法具有较好的准确性和精密度，适合月饼 中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸的测定。 注：A：标准色谱图(100 mg/L)；B：月饼空白样品色谱图； C：空白样品加色谱图(100mg/kg)。 图2 标准色谱图、月饼空白样品及空白样品加标色谱图 表1 苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸的相关性分析 峰号 化合物名称 保留时间(min) 线性方程 相关系数 检出限(mg /kg) 1 苯甲酸 8.025 v=1.212x-1.316 0.99975 0.76 2 山梨酸 6.410 v=1.504x-1.021 0.99981 0.69 3 丙酸 3.686 y=0.817x-0.624 0.99989 0.67 4 脱氢乙酸 6.891 v=0.823x-0.915 0.99976 0.79 3 结 论 和现有国标测定月饼中苯甲酸、山梨酸、丙酸钙及脱氢乙酸的国家标准方法相比，本法同时检测4个项目，运用较少仪器，杂质干扰少，减少了误差，对样品提取过程和测定时间都大幅减少，避免了不同防腐剂因前处理方法不同而造成的人力、物力、财力的消耗；同时上机测定，操作简单方便， 测定结果准确性和精密度好，能够满足季节性大批量样品的测定，符合检测技术的发展趋向。 ( 参 考文献 ) ( [ 1] 中华人民共和国卫生部. GB 2760- 2 011食品安全国家标 准 食品添加剂使用标准[S] .北 京：中国标准出版社， 2011. ) ( [ 2 ] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会. GB/T5009.1-2003食品卫生检验方法理化部分总则[s].北京：中国 标准出版社，2003. ) 表2方法回收率及精密度测定结果(n=6) 防腐剂名称 本底值(mg /kg) 加入值(mg /kg) 平均测定值(mg /kg) 回收率(%) RSD值(%) 苯甲酸 未检出 10.0 9.31 93.1 2.2 30.0 28.4 94.6 2.0 50.0 46.8 93.6 2.4 70.0 65.8 94.0 1.9 100.0 92.8 92.8 2.8 山梨酸 未检出 10.0 9.21 92.1 1.8 30.0 28.8 96.0 2.0 50.0 45.8 91.6 2.7 70.0 66.2 94.6 1.9 100.0 91.5 91.5 2.6 丙酸钙 未检出 10.0 9.28 92.8 2.4 30.0 28.6 95.3 1.6 50.0 45.3 90.6 2.5 70.0 65.8 94.0 1.9 100.0 91.2 91.2 2.9 脱氢乙酸 未检出 10.0 91.8 91.8 2.1 30.0 28.3 94.3 1.8 50.0 45.3 90.6 2.6 70.0 65.8 94.0 1.9 100.0 92.6 92.6 2.1 ( [ 3 ] ] 王宗汉，刘燕，卫润鑫， 等 .高效液相色谱法快速检测食品中 的安赛蜜、苯甲酸、 山 梨酸和糖精钠 [ J ].粮油加 工 ：电子版， 20 1 4，7(7)：7 2 -74. ) ( [4 ]： 朱国强， 韦 丽丽， 江 恩源.多样品同时萃取 - 气相色谱法测定 食品中山梨酸和苯甲酸 [J]. 现 代食品科技，2013，29(5)： ) (上接第4052页) 对降低感染率及感染度非常必要。而只通过卫生防疫部门小范围内的查治，所能起到的作用是有限的。提高各级医院对该病的检出率及加强其对该病的宣传，可有效地达到查、治、防该病的目的。应提高各级医院对防控该病的重视，引导他们采用敏感性强、特异性高的试验进行检测以及引导居民健康体检时选择华支睾吸虫检查项目。 ( 参考文献 ) ( [ 1] 方悦怡，吴军，柳青，等.广东省华支睾吸虫病流行现状调查 和分析[ J ].中国病原生物学杂志，2007，2(1 ) ：54-56. ) ( [ 2 ] 操治国.我国华支睾吸虫病的流行概况及防治对策 [J] . 中国热 带医学，2007，7(8 ) ：14 5 5-1457. ) ( [ 3 ] 马 健强，何伟潮.顺德市人群华支睾吸虫感染及其预防控制工 作回顾[J] . 热带医学杂志，2001，1( 1 ) ： 91-92，1 0 0. ) ( [ 4 ] 谭覃，曾碧强， 马 健强，等.顺德区人体肠道寄生虫感染现状 及防治效果分析[J] . 热带医学杂志，2004，4(4)：435-437. ) ( [5 ] 黄伟宪， 黄 祖星，吴能简，等 . 佛山市肝吸虫病现状研究[J]. 医学动物防物，2008，24 ( 3)：17 6 -180. ) ( [ 6 ] 马 健强，陈国雄，唐弦， 等 .肝吸虫病流行地区人群相关生活习惯及健康知识调查 [J ] . 热 带医学 杂 志，20 0 8，8(8)： 858-860 ，8 65. ) ( 1166-1169. ) ( [ 5 ] 王爱月，翟志雷 ， 卢素格.离子色谱法同时测定碳酸饮料中5种添加剂的方法研究[J] . 现 代 预防医学，2 0 1 3 ，40(1 1 ) ： 2106-2109. ) ( 收稿日期：2014-12-11 ) ( [ 7 ] 钟振伟，苏翠金 . 佛山市 顺 德区华支睾吸虫病流行现况调 查 [ J ] .现代预防医学， 2 010，37 ( 20 ) ：3924-39 2 6. ) ( [8] 谭覃，余卓文， 马 健强，等 .顺 德区部分职业人群肝吸虫 感染 状况及生活方式的调查研究[J]. 热 带医 学 杂 志 ， 2 010，10 ( 7)：886-888. ) ( [ 9 ]Q IAN MB. 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