乳制品中维生素A、D、E 的含量检测方案(气相色谱仪)

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thermoscientific应用指南 赛默飞色谱产品在乳及乳制品分析中的自动化解决方案 吕建霞 张艳海 天金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：：Trace1300 气相色谱仪； U3000 双三元液相色谱；脂肪酸；维生素 引言 配方奶粉是为了满足婴儿的营养需要，在奶粉中加入各种营养成分，以达到接近母乳的效果。它除去牛奶中不符合婴儿吸收利用的成分，甚至可以改进母乳中铁的含量过低等一些不足，是婴儿健康成长所必需的，因此，给婴儿添加配方奶粉成为世界各地普遍采用的做法。但值得注意的是市场上很多奶粉品牌，已经脱离了配方奶粉无限接近母乳的初衷，已经变得越来越“超越”母乳，很多母乳中没有的肆意的添加，或者超出母乳中的含量，过量添加。比如所谓的几倍 DHA，或者给正常体质孩子推荐水解蛋白奶粉，牛初乳的添加，完全不顾及对孩子可能的潜在危害，还要作为产品的卖点大肆宣扬。因此，需要建立一整套的解决方案准确检测婴幼儿配方奶粉中的各种营养成分的含量。 色谱能够实现在线二维柱切换，样品经过皂化、萃取后，直接进样，同时完成维生素A、D、E的分析测定，提高了方法的准确性和样品分析效率。 第一部分 Triplus RSH-GC 联用自动在线衍生测定配方奶粉中的脂肪酸组成 与普通奶粉相比，配方奶粉去除了大部分饱和脂肪酸，加入了植物油，从而增加了不饱和脂肪酸， DHA ( 二十二碳六烯酸，俗称脑黄金)， AA(花生四烯酸)。。 DHA、AA属多元不饱和脂肪酸，在体内由必需脂肪酸亚油酸、亚麻酸转化而 作为科学服务领域领导者，赛默飞拥有业内最齐全的检测手段和解决方案，能够提供婴幼儿配方奶粉中营养成分分析的完整解决方案。Triplus RSH 三合一自动样品处理平台与GC&GC/MS 联用能够实现脂肪酸检测的自动在线衍生，提高测定的准确度与精密度，减少人员的工作量。双三元液相 ThermoFisher 成，能提升婴儿智力发育指数、提升视力敏锐度，对婴儿脑部及视力的发育有重要作用。因此，婴幼儿配方奶粉中添加足量的亚油酸和亚麻酸是关键。 脂肪酸的测定需要经过甲酯化使其成为更容易气化的脂肪酸甲酯，再进入气相色谱仪进行检测。目前的食品安全国家标准《GB5413.27-2010婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》中规定了脂肪酸的检测方法，提供了两种甲酯化的方法：乙酰氯-甲醇甲酯化法；三氟化硼-甲醇甲酯化法。操作步骤繁琐，费时费力；赛默飞的 Triplus RSH 自动样品前处理平台能够实现自动在线衍生，我们只需要把样品和所需试剂摆放在平台上，所有的过程都在平台上自动完成，省时省力，避免了人为操作产生的误差。 赛默飞 Triplus RSH 自动样品前处理平台简介 TriPlus RSH 是赛默飞世尔科技自主研发的三合一自动样品前处理平台，整合了液体自动进样，顶空自动进样，以及固相微萃取功能，最大程度的实现操作自动化，该样品前处理平台可选配加内标、配标准曲线、样品前处理等附件，实现整个实验流程的自动化操作。 图1赛默飞Triplus RSH 自动样品前处理平台 赛默飞GC简介 赛默飞拥有气相色谱及气质联用全线产品，拥有包括气相色谱、单四极杆气质联用、三重四极杆气质联用以及轨道阱气质联用仪。TRACE 1300 系列气相色谱仪围绕受客户需求推动的关键创新而开发，其中包括用户可自行更换安装的Thermo Scientific“即时联接”进样口和检测器，运行分析 时节约氦载气的独特专利解决方案，经优化和微型化的电子元件。TRACE 1300 系列气相色谱仪集快速、易操作、紧凑型设计于一身，为用户提供不可思议的高实验室生产率，同时大大降低了拥有成本!同时首创的“即时链接“模块，省却了复杂的气路和电路连接，即插即用，彻底突破了仪器配置对应用的束缚。 图2赛默飞Trace1300 系列气相色谱仪 赛默飞自动在线衍生测定配方奶粉中的脂肪酸组成之仪器配置 脂肪酸需要甲酯化才能进行气相色谱测定，采用自动在线衍生可以提高工作效率，减少人员与有毒有害试剂的接触，减少人为操作的误差，提高测定的准确度与精密度。采用Triplus RSH 进行在线衍生所需配置见下表 表 1采用 Triplus RSH 进行在线衍生所需配置 图3 Triplus RSH 配置示意图 气相色谱的配置为 Trace 1310 气相色谱仪配 FID 检测器，色谱柱采用脂肪酸甲酯分析专用色谱柱 TR-FAME， 100 m，0.25 mm， 0.20 um ( P/N： 260M238P)。 自动甲酯化和测定过程 脂肪酸甲酯化的步骤比较繁琐，首先需要加入内标，接着加入 NaOH/MeOH溶液，80℃孵化10min， 然后加入 BF3/MeOH溶液80℃甲酯化反应，时间为15min；加入庚烷，饱和氯化钠溶液，混匀，待冷却至室温，将庚烷层转移入2mL进样小瓶中待气相色谱仪分离检测。采用 Triplus RSH可全自动实现上述所有步骤，真正实现自动甲酯化过程。 气相色谱条件：柱温采用程序升温条件如下：60℃(保持1 min)；20 ℃ /min 到160℃， 保持2min， 4℃/min 到240℃(保持15 min)。载气为高纯氮气(纯度99.999%)；流速1.0 mL/min。进样口为 SSL 进样口，温度：260℃，进样模式 split， 分流比， 10：1。检测器温度：280℃，氢气35mL/min， 空气350mL/min，尾吹气氮气40mL/min。 标准样品中37种脂肪酸甲酯的色谱图如图4所示。采用赛默飞的脂肪酸甲酯分析专用析 TR-FAME， 37 种脂肪酸甲酯得到了完全的基线分离，包括多组顺反异构体。 图4脂肪酸甲酯混合标准溶液的色谱图 第二部分在线二维柱切换-高效液相色谱法同时测定婴幼儿强化奶粉中维生素A、D、E的含量 维生素 A( retinol)、D(vitamin D， 和vitamin D，)、E(tocopherol )是机体维持正常代谢和机能的所必需的一类脂溶性维生素。在多种强化食品或饲料中，尤其是婴幼儿配方食品中所必需添加的营养素类成分。在 GB10765-2010中规定了各个维生素的每100kJ 或 100kal 的含量区间及其相关分析方法，准 确测定维生素的含量对控制食品营养和安全具有重要作用。由于样品基质十分复杂，包括脂肪、乳化剂、蛋白、甾醇和其他脂溶性物质等，且各维生素多制备成水溶性微粒再添加到食品中，因此传统分析方法包含了十分复杂的样品制备过程。GB5413.9-2010 液相色谱法是目前现行的测定维生素ADE 的主要方法。该方法需要两套液相和两个熟练的操作人员才能完成。其他参考方法如基于 LC-MS/MS 的同位素内 标法，也有部分用户采用二维柱切换法测定等，但以上方法或操作繁琐、分析效率低，或分析成本高、对操作人员技术水平要求较高，或针对不同基质类样品存在方法耐用性和重现性问题等。 双梯度液相色谱系统 赛默飞UltiMate 3000 双三元液相色谱(DGLC)作为2006年匹兹堡金奖产品，采用独特的双泵设计，每个泵都作为一个单独的体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，可同时单独控控三种不同的流动相， 在 Chromeleon 变色龙软件的控制下，结合独特的阀切换技术，通过灵活的流路连接设计，可以轻松实现在线二维或多维色谱分离等高级应用，帮您解决复杂体系的分离难题。 图5双三元液相系统 基于全自动在线二维液相色谱脂溶性维生素 ADE 分析平台 基于 DGLC 在线二维色谱脂溶性维生素ADE 分析平台，主要针对食品、饲料等复杂基质样品，以方法实用性和操作简便性为目标。样品首先参考 GB 5413.9-2010方法，进行皂化和萃取后即可上机分析。 作为维生素D测定，由于本法无需正相制备净化过程，因此减少了维生素Ｄ 在样品制备过程中的损失，且减少了人为误差，使方法的重现性更好。图6为本法与国标方法样品回收率比较结果，本法回收率更高。 图6回收率对比结果 (M为成人奶粉、IF为婴幼儿配方奶粉、FC为奶酪) 在方法耐用性上，应用本法连续进样200次后，维生素Ｄ仍然可以获得较好的分离度，可见方法耐用性较佳。 经济效益及应用前景分析 与现行标准方法比较，本法具有以下优点：1、自动化程度高。无需正相色谱净化过程，方法重现性好，耐用性较好，且一法多用，适用于强化奶粉(包括婴幼儿配方奶粉)、液态奶、酸奶等乳品以及牛羊预混饲料、浓缩饲料等；2、分析效率高、分析成本低。传统方法需要两套高压液相色谱(一套分析型LC，一套制备型LC)，而本法无需正相色谱净化过程，且一次进样同时完成维生素 ADE 测定，可大大加快样品分析效率，硬件投入只需一套双三元液相色谱配置紫外检测器即可，减少了实际样品分析的仪器成本和人力成本；3、方法可靠。经过大量实验数据比对表明，本法测定结果与标准方法结果基本一致，因此可作为标准方法的备选方法，能够带来较好的社会经济效益。 表2两种方法分析时间比较 时间/min 步骤 GB5413.9-2010 本法 样品提取 皂化 45 45 萃取 30 30 水洗 20 20 脱水 10 10 低温回收溶剂 20 20 制备净化 平衡校正 40 收集馏分 30 氮吹、定容 20 样品制备总时间 215 125 上机分析 30 40 从上表可知，本法无需正相色谱净化过程，而该过程耗时费力，直接影响样品的分析效率。从用户实际应用中了解到，采用GB方法平均每日仅能处理6批样品(包含至少4h的样品制备色谱净化时间)，采用本法平均每日可处理12个样品，因此采用本法可提高1倍的分析效率。在分析成本上，主要是仪器、试剂耗材及其人力成本，本法无需正相色谱制备过程，因此仪器及试剂、耗材成本约减少40%，人力成本减少50%。综上应用全自动化在线二维色谱法分析维生素 ADE 可带来较好的经济效益。基于 DGLC 所构建全自动在线二维色谱分析平台，具有较好的普适性，除适用于强化奶粉(包括婴幼儿配方奶粉)和液态奶等乳品以及牛羊预混饲料、浓缩饲料外，还可应用于其他强化食品，包括保健品(如代餐饮品、复合维生素片和维生素Ｄ钙软胶囊等)和药品维生素 AD 滴剂中脂溶性维生素的分析，真正实现“一法多用”。除维生素D测定外，还可推广至所有基于中心切割模式的在线二维色谱定量分析中，因此具有较好的应用前景。 学俱乐部 谱应用技术群 www.thermofisher.com 总结 赛默飞世尔科技作为科学服务领域领导者，拥有业内最齐全的检测手段和解决方案，能够提供婴幼儿配方奶粉中营养成分分析的完整解决方案。。 Triplus RSH三合一自动样品处理平台与 GC联用能够实现脂肪酸检测的自动在线衍生，操作人员只需要摆放好样品和试剂，后续一切操作均有 RSH 自动完成，减少人员与有毒有害物质的接触，提高测定的准确度与精密度。双三元液相色谱能够实现在线二维柱切换，样品经过皂化、萃取后，直接进样，同时完成维生素A、D、E的分析测定，提高了方法的准确性和样品分析效率。赛默飞世尔科技，一如既往地坚持赛默飞“致力于帮助客户使世界更健康，更清洁，更安全”的宗旨，全力使我们的世界变得更健康、更清洁、更安全。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 全国服务热线：800810 5118400 650 5118(支持手机用户) S CIENTIFIC