奶粉中维生素A、D和E异构体含量检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientific热线 800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 在线固相萃取-二维液相色谱法分析配方奶粉中的维生素A、D和E异构体含量 刘兴国曹建明金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 在线固相萃取，二维液相色谱，维生素A，维生素D，维生素E，生育酚，配方奶粉 本文基于赛默飞Vanquish液相色谱系统，建立了在线固相萃取-二维液相色谱分析定量配方奶粉中维生素A、D和E异构体的方法。双三元的两个泵分别作为SPE泵和一维泵，另外一台四元泵作为二维泵，采用聚合物基质的在线固相萃取柱可以实现皂化液定容后直接上样测定，简化了前处理步骤，减少了人与有机试剂的大量接触，提升了分析效率。 1.引言 维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一种微量有机物质，根据物理性质不同分为水溶性和脂溶性两大类，其中脂溶性维生素A、D、E在人体的视觉能力、免疫功能、抗氧化抗衰老能力等诸方面都有着重要的生理功能。维生素不足会造成人体的亚健康，因此对于维生素的补充越来越受到人们的重视。婴幼儿及成人配方乳品是脂溶性维生素强化的重要形式之一。 针对奶粉样品基质复杂的特点，我国l和欧洲帐的关于食品中维生素D现行标准方法中，需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，分析效率很低。本文在前期研究的基础上[4.5，优化色谱条件，采用在线固相萃取的方式代替传统的离线液液萃取、蒸干复溶的步骤，并结合二维液相实现了配方奶粉维生素A、维生素D，和D，以及维生素E异构体的快速同时分析。 2.1仪器 ( Thermo Fish e r Vanquish高效液相色谱仪 ) ( 泵： Vanquish Dual Pump (VF-P32-A-01)和Vanquish quate-ry Pump (VF-P20-A) ) ( 自动进样器： Vanquish Autosampler (VF-A10-A， 100pL Samp-leLoop) ) ( 柱温箱： Vanquish Column Compartment (VH-C10-A，含两个 Viper Only 2p-6p切换阀) ) ( 检测器： Vanquish Diode Array Detector HL(含10mm或60mm光纤池)， U 3 000 VWD3100 Detector (含11pL流通池) ) 样品收集环体积：500pL，色谱软件：变色龙Chromeleon 7.3 2.2试剂与标准品 2.2.1试剂：乙腈、甲醇、乙乙、异丙醇(色谱级，Fisher公司)，去离子水(18.2MA， Millipore纯水机)，氢氧化钾、抗坏血酸、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。 2.2.2标准品：维生素A(all-trans retinol，≥95%，Sigma-Aldrich)，维生素D，(98.1%， Dr.Ehrenstorfer GmbH)，维生素D。(99.6%， Dr.Ehrenstorfer GmbH)，α-生育酚(α-tocopherol， 98.0%， Sigma-Aldrich)，丫、8-生育酚(>96%， Sigma-Aldrich)。 2.3对照品溶液制备 分别精密称量维生素A、D，、D，α、y和8-生育酚标准品适量，至10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度分别为0.0623、0.097、0.097、1.144、2.651和2.062mg/mL的标准品溶液。 标准混合溶液制备为分别精密量取上述维生素A、D，、D，，a、y和8-生育酚标准品溶液适量， 至10mL棕色容量瓶中，50%乙醇稀释定容成系列标准混合溶液。 2.4供试品溶液制备 参考GB5009.82-2016的方法，精密称取固体奶粉试样约5g(精确到0.01g)于150mL平底烧瓶中，用约30mL 45℃~50℃温水使其溶解，混匀。于上述处理的试样溶液中加入1.0g抗坏血酸和0.1g BHT， 混匀，加入30mL无水乙醇，充分混匀后加入约20mL 0.5g/g的氢氧化钾水溶液混匀，在80℃恒温水浴振荡皂化约30min后，取出立刻用冷水冷却到室温，用50%乙醇水溶液转移并定容到100mL量瓶中。皂化液高速离心5~10min (>5000rpm) 后用0.22um尼龙材质针式过滤器过滤后上机分析。 2.5色谱条件 SPE柱： PLRP-S(12.5mmx4.6 mm) 一维色谱柱： VITADE-003K1 (150 mmx3.0 mm， 3.0 um)二维色谱柱： VITADE-004K1 (100 mmx4.6 mm， 2.6 um) 流动相： SPE pump A：酒醇：水=4：6，B：乙腈：异丙醇=1：1；1D pumpA： 乙腈， B： 水； 2D pump A： 乙青，B：甲醇，C：水。 进样体积：100pL 柱温：30C 检测器条件： VWD0min，325nm， 10min 296nm； DAD 264nm阀切换程序见表1，梯度洗脱条件见表2。 表1阀切换程序 时间(min) 上阀 下阀 0.0 6_1 61 4.0 1_2 61 6.0 6_1 61 14.15 6_1 12 14.55 61 61 表2梯度洗脱条件 SPE pump 1D pump 2D pump Time. Flow Time， Flow Time， Flow min rate B% min rate B% min rate B% C% 0.0 1.0 0 0.0 0.8 50 0.0 1.3 40 0 4.0 1.0 0 2.0 0.8 20 6.0 1.3 40 0 4.1 1.0 100 6.0 0.8 20 6.5 1.3 0 60) 11.0 1.0 100 16.0 0.8 0 15.0 1.3 0 60 11.5 0.3 100 22.0 0.8 16.5 1.3 0 0 20 0.3 100 22.1 0.8 50 23 1.3 40 0 20.5 1.0 0 28 0.8 50 28 1.3 40 0 仪器连接图： 图1仪器连接图(两个检测器两个六通阀) 3.实验结果与讨论 3.1对照品和样品溶液测定谱图 对照品和样品溶液分析谱图见图2和图3(图2为Vd测定谱图，图3为Va和Ve测定谱图)。 图2.Vd测定谱图(a为对照品，b为样品) UV_VIS_1WVL：325nm 图3.Va和Ve测定谱图(a为对照品，b为样品) 3.2方法线性及定量限 分别精密量取维生素A、D，、D，α、(、丫y、8-生育酚对照品溶液适量， 至10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释成系列标准混合溶液，进样100uL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察方法的线性范围及定量限。结果显示，各化合物在其浓度范围内线性良好，相关系数均>0.9990。方法灵敏度较高，维生素D，定量限满足要求，方法线性及定量限(S/N>10)结果见表3。 表3方法线性及定量限结果 Vitamins Detection wavelength，nm Range，ug/mL Linearity equation R LOQ，ng/mL VA DAD， 325 0.025-0.374 Y=24.670x-0.178 0.9990 4.151 α-VE 0.915-13.728 Y=0.777x-0.271 0.9994 7.626 y-VE DAD，296 2.121-21.211 Y=0.839x-0.433 0.9991 17.676 8 -VE 1.649-24.740 Y=0.879x-0.348 0.9992 13.744 VD， VWD， 264 0.006-0.097 Y=1.029x+0.006 0.9990 6.487 VD， VWD， 264 0.006-0.097 Y=1.395x+0.008 0.9991 6.473 取市售某品牌配方奶粉样品，按供试品溶液制备方法制备样品，进液相色谱仪测定各维生素含量，结果见表4。 表4样品测定结果 sample Content (ug/100 g for VA，VD； mg/100 g for VE) VA VD， α-VE y-VE 8 -VE 样品测得 577.00 9.20 18.50 1.829 0.311 样品标识 453.00 9.00 14.00 一 结论 本方法基于赛默飞Vanquish液相色谱平台搭建在线固相萃取-二维液相色谱方法，采用三泵两个检测器的仪器搭配实现了皂化液直接上样维生素A、D、E异构体的测定，采用高灵敏度光纤池可以满足低含量维生素D的检测，提高了奶粉样品中脂溶性维生素的分析效率，对日常奶粉检测与评价具有重要意义。 ( 叫孙长，孙秀发，凌文华，等.营养与食品卫生学M. 6版.北京：人民卫生出版社，200 7 ：76-77. ) ( GB 5009.82-2016， De t ermination of v i tamins A ， D ， E infoods. National food safety standard. ) ( 3 BS EN 12821：2009， Foodstuffs -Determination of vitamin Dby high performance liquid Chromatography - Measure- ment of cholecalciferol (D，) or ergocalciferol (D，). ) ( [4]张艳海，其布勒哈斯，金燕，等.在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A， D，和E的含量.色谱，2015，33(3)：291-297. Zhang YH， Qibule HS， J in Y， et al. s im ultaneous determination of vitamins A. D . a nd E i n infant formula and adult n u trition by o nline Two-dimensional liqui d chromatography . Chi-nese j ournal of chromatography， 2015， 33 (3)：291- 297. ) ( AN_19048 HPLC_食品_固相萃取-在线二维液相色谱同时 测定婴幼儿配方奶粉中维生素A、D和四种维生素E生育酚 异构体含量. ) thermoscientific 附录 对于需要测定Va异构体或Va在一维柱有杂质干扰的样品(如小米粉)，可以通过增加一次Va的中心切割，到二维进行Va检测。仪器方法需要增加两次切阀(7.9min下阀6_1；8.3min下阀1_2)，二维流动相条件改变见表5，，-二维检测增加325nm波长。测定谱图见图4。 表5梯度洗脱条件 20.5 A% 100 0 28.0 A% 50 50 30.0 40 0 60 Time， min B% Time， min B% Time. min A% B% C% 0.0 100 0 0.0 50 50 0.0 40 0 60 4.0 100 0 2.0 80 20 15.0 40 0 60 4.1 0 100 6.0 80 20 20.0 100 0 11.0 100 16.0 100 0 26.0 85 15 0 11.5 o 100 22.0 100 29.0 60 40 0 20.0 100 22.1 50 50 29.5 0 100 0 20.5 100 0 28.0 50 50 30.0 40 0 60 图4.Va中心切割后测定谱图(a为对照品，b为样品) 本方法基于赛默飞Vanquish液相色谱平台搭建在线固相萃取-二维液相色谱方法，采用三泵两个检测器的仪器搭配实现了皂化液直接上样维生素A、D、E异构体的测定，采用高灵敏度光纤池可以满足低含量维生素D的检测，提高了奶粉样品中脂溶性维生素的分析效率，对日常奶粉检测与评价具有重要意义。