婴幼儿强化奶粉中维生素A、D3、E的含量检测方案(液相色谱柱)

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2 3 张艳海金燕 赛默飞(中国)有限公司 关键词：高效液相色谱，维生素D，维生素A，维生素E，二维色谱，婴幼儿配方奶粉 Key words： Two-dimensional separation， vitamin D， vitamin A， vitamin E，high performance liquid chromatography， dual gradient system， Fortified Infantformulae 引言 婴幼儿配方奶粉又称为母乳化奶粉，是一种以牛乳(或其他动物乳)为主要原料，通过调整成分模拟母乳，可供婴幼儿生长和发育所需要的一种人工食品。根据国家标准中奶粉营养成分有关规定，维生素指标中必须强化的包括维生素A、维生素D和维生素E及其他水溶性维生素等；其中维生素D在实际母乳中含量极低，约为4-40IU(国际单位)/L(0.1-1.0pg/L)，主要对应形式为维生素D。和25-OH维生素D3， 因此通常将维生素D。制成水可分散性的微粒形式，添加到婴幼儿强化奶粉中。关于奶粉中维生素A、D和E的测定方法，文献报道较多，其中高效液相色谱法是常用的分析方法。由于样品基质复杂，三种维生素对温度、光照、氧气和极端的pH值较敏感，且多数经过包被后再添加到食品基质中，因此分析方法常包括皂化破壁、有机溶剂萃取，浓缩和净化等步骤，在现行标准分析方法中需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，前处理过程极其繁琐，大大影响样品分析效率。 本文首次采用在线二维柱切换-高效液相色谱紫外检测法，样品经过皂化、萃取后，直接进样，同时完成维生素A、D和E的分析测定，提高了方法的准确性和样品分析效率。 测试条件 仪器： UltiMate DGP 3600系列，包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵；带有两个六通阀的柱温箱；紫外检测器。连接图见图1。 柱温：30℃ 检测波长：0~5min， 325nm； 5~12min， 296nm；12~30min， 263nm 进样量：50pL 图1仪器连接图 流速：0.8mL/min 流动相组成： 一维分析泵：A，乙腈；B，甲醇；C，甲醇-四氢呋喃(80：20) 二维分析泵：A，乙腈；B，异丙醇 流速：0.8mL/min 梯度洗脱程序：见表1。 样品前处理 精密称取取粉10g(液态奶50mL)，于250mL锥形瓶中，加入30mL热水使溶解(液态奶不需加入)，再加入15g/L的维生素C乙醇溶液100mL， 再加入55%的氢氧化钾水溶液25mL，磁力搅拌45min， 温度53℃。将皂化液移至500mL分液漏斗中，以石油醚萃取3次，每次100mL，合并萃取液，萃取液以水洗涤3~5次，至中性(pH试纸测试)，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水。低温减压回收石油醚，至1~2mL时转移至10mL棕色瓶中，氮气吹干，再以3~5mL甲醇使溶解并转移至10mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，待用。未用完溶液放入4℃冰箱保存。 一维分析泵 二维分析泵 One-dimension analytical pump Two-dimension analytical pump 时间(min) A% B% C% 时间(min) A% B% Time (min) Time (min) 0 60 40 0 0 100 0 15 60 40 0 9 100 0 15.1 0 0 100 25 80 20 25 0 0 100 28 80 20 25.1 60 40 0 28.1 100 0 30 60 40 0 30 100 0 标准品和样品色谱图 图2采用二维柱切换法测定维生素A、D2、D，和E的分离谱图(1标准品，2样品) 方法学考察 方法线性范围、定量限、精密度考察 分别精密量取维生素D3、维生素A和E的标准工作溶液适量，至10mL棕色量瓶中，制成系列混合标准品溶液，再分别精密加入等量的浓度为10 mg/L的维生素D的内标溶液0.5mL，甲醇稀释至刻度，进样50uL，以浓度为横坐标，维生素D。/D，峰面积比值为纵坐标，做线性回归，结果维生素D。在20~2000g/L的范围内，相关系数r为0.9995；维生素A在1.71~855mg/L的范围内， r为0.9979；维生素E在4.12~1030mg/L范围内，r为0.9998。其中维生素D。最低定量限为20pg/Kg，相当于800IU/Kg。 取已知混合标准品溶液，连续进样6次，结果维生素D2，维生素D，的峰面积的RSD分别为1.94%和2.82%，维生素E峰面积的RSD为0.44%，维生素A峰面积的RSD为0.43%，表明方法的精密度较好。 回收率实验 分别取某品牌婴幼儿配方奶粉样品3份，每份10g，精密称定，分别精密加入浓度为10mg/L的维生素D，的内标溶液0.5mL， 再分别加入维生素A、Dg、E的标准品适量，按照2.4项下处理样品并测定维生素A、Dg、E的总量，计算回收率。结果维生素A、D3、E的平均回收率分别为114%、100.68%和93.98%，其相应的RSD分别为0.16%，2.9%和0.58%。 样品含量测定结果 分别取各品牌婴幼儿和儿童配方奶粉10g，精密称定，按照2.4项下的样品溶液制备方法制备样品溶液，测定维生素A、D。和E的含量，结果见表3。 讨论 二维色谱流路构建和阀切换时间的确定 维生素A、E在配方奶粉中含量较高，样品经过皂化萃取后，可直接在一维色谱柱中实现分离。维生素D含量较低，且样品基质干扰较大，原标准方法需经过正相制备色谱的净化，再将含有维生素D的馏分蒸干定容后，再在反相色谱上进行分析。本文采用二维色谱分离的中心切割法，样品在一维色谱柱实现初步分离后，将含有维 表3样品含量测定结果 Table 3 Contents of vitamins A， E and D3 in samples 样品名称 Sample name 维生素A(mg/Kg) 维生素E(mg/Kg) 维生素D3(pg/Kg) 标示量 测得量 标示量 测得量 标示量 测得量 Marked value Found value Marked value Found value Marked value Found value 奶粉-1 5.70 6.16 40 40.9 79 84 奶粉-2 5.91 6.49 87 83 84 76 奶粉-3 4.50 5.04 150 132 80 70 AD钙奶 0.06 0.065 一 17 14.5 生素D的馏分切割至二维色谱柱中进行分离。系统连接图见图1。由于外界因素影响，维生素D在一维色谱分离中的保留时间会有微小波动，因此切割的时间窗太窄容易造成目标物的损失，时间窗太宽，会使切换到二维分离柱的溶剂体积过大，对二维分离产生溶剂效应，本实验通过连续进样，考察了保留时间波动范围，确定了最终的切换时间。在一维色谱分离中，维生素A、E在12 min内即可完成分离过程，而在二维色谱分离中维生素D的保留时间约为21~22min，因此方法采用两位置六通阀实现了色谱柱后的紫外检测器共用。左侧阀的切换时间定在12min， 在12min之前，一维色谱柱与检测器连接；在12min之后，二维色谱柱与检测器连接，从而实现维生素A、D和E的同时检测。 色谱分离条件选择 在色谱分离模式选择上，文献中一般采用正相色谱或反相色谱法进行分析。反相色谱法的优势是可以将维生素D、维生素D，以及维生素D前体和非活性的异构体分开，因此可以选择维生素D作为内标，以补偿在前处理过程中维生素D的损失，提高测定结果的准确性和可靠性，另外考虑到流动相的兼容性，本实验在一维色谱和二维色谱分离中均采用反相色谱法。在色谱柱选择上，-9二维分离选择性的变化能够改善样品的2个或更多色谱峰的分离度，能使色谱图中被大峰掩盖的小峰分离出来，减少色谱峰重叠，因此实验中采用C18作为一维分析柱，采用PAⅡ C18( Embedded-polar-group C18) 作为二维分析柱。在流动相选择上，甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇以及水是常用溶剂，由于样品溶液中含有大量低极性的物质，因此本实验采用了非水反相系统，以增加低极性物质的溶剂度。在一维色谱分离中，为减少强保留、低极性成分的干扰，在维生素A、E分离结束后，加入了四氢呋喃-甲醇的混合溶剂清洗色谱柱的过程。本实验对比了一维常规分离谱图(见图3)和二维柱切换法的分离谱图(图2)，可以看出后者分离结果较好。 图3常规分离谱图 (1维生素D、D标准品溶液；2加VD，的样品) Fig. 3 Separation chromatogram of vitamins D2， Ds byusing routine method (1 D2 and D standard， 2 infantformula sample spiked vitamin D2.) 本文建立了在线二维柱切换-紫外检测法测定婴幼儿配方奶粉和乳品中维生素A、D。和E的含量测定方法，本方法具有以下特点： (1)二维分离方法可以减少色谱峰重叠现象。在维生素D。测定中，利用一维和二维色谱柱分离选择性差异，可以更好的降低复杂基质成分对维生素D，测定的干扰。 (2)与国标方法比较，本方法可减少正相色谱的净化过程，，一次进样同时测定脂溶性维生素A， E和D。的含量，大大提高了样品的分析效率。 (3)在检测方法选择上，紫外检测器和电化学检测器是应用较多的两种检测器。质谱检测器在复杂基质样品中对痕量组分的定性和定量上具有优势，在婴幼儿奶粉检测中应用也越来越多。本文立足于方法的普适性，选择紫外检测器，利用其波长切换方式，同时分析维生素A，E和Ds，通过一个六通切换阀，实现检测器的共用，所有过程在软件支持下，可以实现全自动化控制。 作为二维分离方法，相对于常规分析，仍较复杂，影响测定结果的因素较多。今后本实验将继续扩大样品分析范围，考察方法耐用性，并开展联合实验室的验证工作，以完成对方法的综合评价。 ( 1 Z 2 HAO Rong， XUE Ying， WU Guo-Hua， ZHAO Hai-Yan， L UO Ren-Cai. 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