奶粉中维生素A，D和4种VE异构体的含量检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientific 在线二维液相色谱法快速同时测定婴幼儿配方奶粉中维生素A， D和4种VE 异构体的含量Simultaneous determination vitamins A， Dand four E isomers in infant formula by onlinetwo-dimensional liquid chromatography 高效液相色谱，维生素A，维生素D，α-生育酚， β-生育酚，y-生育酚，8-生育酚，二维色谱，婴幼儿配方奶粉 Key words： Two-dimensional separation， vitamin D，α-retinol， β-retinol， y-retinol， 8-retinol， vitamin A，high performance liquid chromatography， Infant formula 引言 维生素 A (retinol)、维生素 D ( vitaminD， 和 vitamin D)、维生素E(tocopherol) 是机体维持正常代谢和机能的所必需的脂溶性维生素。其中维生素E有8种异构体形式，即4种生育酚(α、β、、y、8-tocopherols)和4种三烯生育酚(α、β、y、8-tocotrienols)，均具有重要的生物活性，被认为是一类主要的抗氧化剂。通常α-生育酚被报道是活性最高的一种维生素E形式，因此很多文献报道的分析方法仅测定了α-生育酚的含量2-4。最近研究表明，其他几种异构体形式也在人体中具有重要的作用，并且y-生育酚具有抗癌作用同。维生素E异构体结构的复杂性和活性的差异，决定了建立一种准确可靠的分析方法，来分离和测定食品基质中各个异构体含量，具有重要意义。目前分离维生素E 异构体的方法有薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法，其中基于正相色谱分离的高效液相色谱法是常用方法。另外维生素D也是婴幼儿配方食品中一种重要的营养素，但因为其在食品中含量较低，且对光热 较敏感，再加上复杂的食品基质成分干扰，决定了其分析方法也十分复杂。我国和欧洲的关于食品中维生素D现行标准方法中，需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，极大的影响样品分析效率。 本文在前期工作中已建立同时测定食品中维生素A，D 和α-维生素E含量的在线二维液相色谱法10]，在此基础上，本文又继续优化了色谱条件，，-一维色谱结合荧光检测器完成维生素A和4种生育酚异构体的分离和定量，二维色谱完成维生素D的定量，大大改善了样品的分析效率。 ThermoFisher 仪器和软件 ( Thermo S c ientific TM Dionex TM UltiMate T M 3000 x2 Dual HPLC system， including： ) ( - DGP-3600RS Dual- G radient Rapid Separation PumpSystem with S RD-3600 Integrated Solvent and D e gasser Rack ) ( - WPS-3000TRS Rapid Separation W e llplate Sampler，Thermostatted， with a 100 pL sample l oop and a 1 00uL syringe ) ( - TCC-3000RS Rapid Separation T hermostatted C olumnCompartment equipped with two 2p-6p valves- DAD-3000RS Rapid Separation D iode Array Detectorwith 2.5 uL flow cell ) -Sample Loop for 500 uL Volume ●Thermo Scientific TM [Dionex TM ChromeleonTMChromatography Data System (CDS) software version 7.2 SR3 试剂和材料 维生素 Ds (>95%， HPLC 级，供含量测定用，中国药品生物制品检定所)。维生素 D(> 95%， HPLC 级，供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；维生素A(all-trans retinol，， >95%， Acros Organics)、α-维生素E(α-tocopherol， ≥96%， Sigma， HPLC)，β、y、8-生育酚(纯度>96%， HPLC， 购自 Supelco)。 氢氧化钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈、甲醇(色谱级， Fisher 公司)，去离子水(18.2MQ，Millipore纯水机)，抗坏血酸(≥95%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。 标准品溶液制备 取维生素A、D2、D。和E标准品适量，精密称定，至25mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度分别为1.0 mg/mL 维生素 D和D，溶液，1.24 mg/mL维生素A溶液和2.06 mg/mL 维生素E储备溶液。 分别精密量取维生素Dg、维生素A和E的标准品溶液适量，至 10 mL棕色量瓶中，成系列标准品混合溶液，再分别精密加入等量的浓度为 10 pg/mL 的维生素D，的内标溶液，甲醇稀释至刻度，各标准品浓度见表 1。 Table 1. Preparation of mixed working standard solutions of fat-soluble vitamins. Mixed working standard solution RT.min 1 2 3 4 5 6 VA 10.59 0.124 0.248 0.413 0.62 1.24 6.2 α-VE 17.022 0.24 0.48 2.4 12 24 120 Concentration of each vitamins β-VE 22.26 0.2 0.4 2 10 20 100 (pg/mL) Y-VE 22.68 0.16 0.32 1.6 8 16 80 8--VE 21.11 0.24 0.48 2.4 12 24 120 VD： 27.097 0.02 0.04 0.08 0.4 2 10 样品溶液制备 参考 GB 5413.9-20105的方法，精密称取奶粉 10 g，于250 mL 锥形瓶中，加入30 mL 热水使溶解(液态奶不需加入)，再加入15 g/L 的维生素C乙醇溶液100 mL，再加入1.25 g/mL 的氢氧化钾溶液 25 mL， 精密加入10 pg/mL的维生素D，内标溶液 1.0mL， 磁力搅拌45分钟，温度60±2℃。将皂化液转移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取3次(若出现乳化，可加饱和的氯化钠溶液破乳)，每次100 mL， 合并萃取液，萃取液以水洗涤至偏中性(pH试纸测试)，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水。低温减压回收石油醚，至1~2mL 时转移至10mL棕色瓶中，氮气吹干，再以3~5mL甲醇使溶解并转移至10 mL 棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，待用。未用完溶液放入4℃冰箱保存。 色谱条件 流动相C 水 一维及二维梯度程序见表2，阀切换时间及过程见表3。 表2.一维分离和二维分离梯度程序 一维分析泵 二维分析泵 时间(分钟)时间(分钟)A% B% C%A% B%T C%ime (min)Time ( min) 0 50 0 50 0 40 0 60 3 50 0 50 21 40 0 60 6 0 75 25 23 100 0 0 21 0 90 10 31 60 40 0 23 0 100 0 34 60 40 0 30 0 100 0 35 40 0 60 表3.阀切换时间及过程 系统连接见图1。 图1.全自动在线二维柱切换系统流路示意图 结果与讨论色谱条件优化 本文所建立的在线二维液相色谱法测定维生素A，D和E的4种异构体，从色谱柱选择上，主要考虑从以下几个方面进行优化：首先作为一维色谱柱，维生素E要实现基线分离，这是准确定量的前提；其次要考虑到 VD 的净化过程效果，以及要兼顾到 VD， 和 VD的分离等。在一维色谱柱选择上，在 FOODKIT2 ADE 专用色谱柱可实现4种生育酚异构体的基线分离，且 VD、VD色谱峰在该色谱柱上重叠，利用此特点可减少 VD馏分(即从一维色谱柱将含 VD，和VD切割至二维色谱柱中)的溶剂体积，从而减少对二维色谱分离的溶剂效应，确保二维色谱柱的分离柱效。因此确定该色谱柱作为一维色谱柱。在前期方法的基础上10]，本文仍选择极性改性的反相色谱柱作为第二维色谱柱，保持了一维和二维色谱柱良好的正交性，结果VD、VDg分离较好，可对 VD2， VD， 进行准确定量。荧光检测器仅对有荧光吸收的化合物有响应，具有灵敏度高、选择性好等特点。维生素E具有较好的荧光响应，因此本实验在紫外检测器的基础上，串联了荧光检测器，既能提高维生素E的检测灵敏度，也可减少了部分复杂奶粉基质成分对维生素E分离和定量的影响，弥补了紫外检测上的不足。混合标准品溶液分析谱图及典型的样品分析谱图分别见图2和图3。 15.0.)- A 图2.维生素A、D3、E标准品分析谱图(A， 其中 0~20 min 为一维分离谱图， 20~30 min 为二维分离谱图)和二维分离放大图谱(B) 图3.婴幼儿配方奶粉样品分析谱图(A)、二维分离放大图谱(B，264nm)及其中 VD，色谱峰的紫外扫描谱图(C) 线性、最低定量限、精密度实验 分别精密量取维生素A、D2、Dg和α，β，y，8-维生素E的标准品溶液适量， 至10mL棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成系列标准品混合溶液，进样5uL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察方法的线性范围。结果各目标化合物在其浓度范围内，线性相关系数>0.999，表明各化合物线性相关关系较好。线性方程及其方法检出限的结果见表4。 Table 4. Calibration data and MDLs for the fatty-soluble vitamins Fatty- Detection Range Regression MDL solublevitamins wavelength(nm) (ug/mL) equation r (ug/mL) A 325 0.44-174.0 v=0.3120x-0.0527 0.9999 0.0082 D： 264 0.04-4 v=0.3643x-0.0028 0.9999 0.015 D2 264 0.04-4 y=0.2519x-0.0034 0.9997 0.015 α-VE 296 2.4-120 v=13292.5x-57679.1 0.9990 0.068 β-VE 296 0.4-100 y=47811.7x-78353.7 0.9994 0.035 y-VE 296 0.32-80 y=61533.3x-78492.2 0.9994 0.025 8-VE 296 0.48-120 y=77930.7x-118076.70.9996 0.015 取 0.1 ug/mL 的混合标准品溶液，连续进样6次，结果VD。的峰面积的 RSD 分别为 0.82%，维生素A峰面积的 RSD为 1.89%， α，β，y， 8-VE 峰面积的 RSD分别为2.53%，1.79%，1.64%和1.1%，表明连续进样，方法精密度较好。 样品测定 取市售的两份婴幼儿配方奶粉样品，每份10g， 精密称定，按照2.2.2中样品溶液制备方法制备样品溶液，测定结果见表5. 表5.样品维生素A、D。和E含量测定结果(n=2) Name Content (pg/100 g for VA，D； mg/100 g for VE) VA VD a-VE B-VE Y-VE 8 -VE 婴幼儿配方奶粉-1 778 11.48 16.51 0.72 11.2 2.51 婴幼儿配方奶粉-2 894 10.04 14.33 0.50 7.37 2.42 采用本法测得 VA ， VD，及 α-VE 的含量均在标示量范围内。另外样品中 y-VE 和 8-VE 的含量也较高，而 β-VE含量相对较低，两个样品中α、β、y和8-VE含量比例总体上趋于一致。虽奶粉营养标签中未标示β，y和8-VE的含量，但4种VE 异构体的总含量及其比例，对评价 VE的总体效价，控制产品质量具有重要意义。 结论 本文基于二维色谱原理，利用双梯度泵系统，结合两个切换阀，构建了全自动在线二维液相色谱分析方法，通过紫外检测器和荧光检测器的串联，一次进样同时完成脂溶性维生素A，D2， D及其α，β，y和8-VE的定量分析，方法验证结果表明，本法能够准确测定婴幼儿配方奶粉中各待测营养素的含量。且4种VE异构体的拆分和定量，对于产品的质量控制具有重要意义。另外本法自动化程度高，操作简便快速，可用于日常奶粉样品的检测工作中。 ( 参考文献 ) ( [1] Hewavitharana A K .， Lanari M C ， Becu C . ，J.Chromatogr. 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