厄贝沙坦中叠氮根离子检测方案(离子色谱仪)

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29001woThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified. 钟乃飞赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：离子色谱；电导；厄贝沙坦；叠氮根离子 Key words： lon chromatography； conductivity； irbesartan； azide ion； 引言 厄贝沙坦 (irbesartan)，适用于治疗原发性高血压，是一种新型血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，具有良好的降压作用和极少的不良反应。目前，该药已列入《国家基本医疗保险药品目录》，市场应用普遍。厄贝沙坦为2-正丁基-3-[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺[4，4]-壬-1-烯-4-酮(中间体)与叠氮化钠(NaN)经环加成制得，由合成工艺可知，产品中易引入叠氮根离子。叠氮化物，为剧毒物质，因此，对厄贝沙坦原料进行叠氮根离子的控制是十分必要的。 美国药典(USP35-NF30)和欧洲药典(EP7.0)[4均采用离子色谱法测定叠氮根离子，以100mmol/L的氢氧化钠为淋洗液，采用强保留离子色谱柱进行分离，叠氮根离子限度为不得过10mg/L。本方法采用柱切换离子色谱法[5-10]测定厄贝沙坦中的叠氮根离子，以90%甲醇为溶剂溶解样品后直接进样，预处理柱(NG1柱)、富集柱(TAC-ULP1柱)和分析柱(lonPac AS18柱)以适当的方式与六通阀连接，使之能并联、串联切换使用。预处理柱和富集柱作为前处理柱用于色谱柱前的样品处理，在去除样品基质的同时富集待测组分，又可保护分析柱，延长分析柱的寿命。该方法操作简便，并可在脂溶性药物的痕量离子测定中广泛应用。 仪器： ThermoFisher公司ICS 5000系统(配等度泵+低压四元梯度泵)； 分析柱： lonPac AS 18， 250×4mm(P/N： 060549) 保护柱： lonPac AG 18， 50×4mm ( P/N： 060551) 浓缩柱： lonPac TAC-ULP1，23×5mm， (P/N： 061400)； 前处理柱： lonPac NG1， 35×4mm， ( P/N： 039567)； 柱温：30℃； 流速：1.00mL/min；定量环：200uL；淋洗液源：带有CR-ATC的EGCII KOH； KOH梯度淋洗液程序为：0~18min， 9mmol/LKOH(分离)，18~26 min， 40 mmol/LKOH(冲洗)，26~34min， 9mmol/LKOH(平衡)。 低压四元梯度泵： 流速：0.5mL/min 流动相：0~4min，100%水(带动样品到浓缩柱中)，4~14 min， 100%乙腈(将疏水性物质冲洗到废液)，14~34 min，100%水(平衡系统)。 检测方式：抑制型电导检测器， ASRS 300型(4mm)电化学自再生抑制器，自循环电抑制，电流为99mA。 样品前处理 图1-图3给出了色谱系统的工作过程，在连接时尽量缩短仪器单元与单元之间的连接线，以减少死体积。图1中样品装载到定量环。六通阀切换至图2状态时，厄贝沙坦样品随去离子水进入NG1柱和TAC-ULP1中，疏水性厄贝沙坦被吸附在NG1柱中，N。离子在NG1柱中不保留，瞬间洗脱后被富集在TAC-ULP1中，废液排空。4min后，六通阀切换至图3状态， TAC-ULP1柱与分离柱连接，被富集的N。经淋洗液梯度洗脱进行分离测定；同时用乙腈洗脱NG1柱中截留的厄贝沙坦。图2切换至图3的时间(4min)经方法摸索后确定，可以避免厄贝沙坦及溶剂甲醇的干扰，并保证N。离子没有损失。 图1仪器链接图(装载到定量环) 图2仪器链接图(0~4min) 图3仪器链接图(4~34min) 结果和讨论 分离条件的优化 考虑到Br和NO，离子可能在实际样品中存在且容易对N，离子的测定造成干扰，故照2.2方法配制系统适用性溶液，选用AS18阴离子分析柱在9mmol/L KOH的淋洗液条件下各离子分离情况良好，保留时间合适， N。离子后出峰的杂质，用40mmol/L KOH洗脱。结果如图4所示。 图4系统适用性溶液色谱图 样品溶解溶剂的选择 厄贝沙坦为脂溶性物质，在甲醇中的溶解性较好，在水或低浓度的KOH淋洗液中不溶。参照美国药典， 厄贝沙坦样品溶液的浓度为20mg/mL，故首选甲醇为溶解溶剂。考虑到100%甲醇溶解样品可能会影响叠氮根的离子化，故分别选用85%，90%和95%的甲醇配制20mg/mL的厄贝沙坦加标溶液进行试验。85%甲醇可恰好溶解样品，但短时间放置厄贝沙坦即会析出；90%和95%甲醇测定结果一致，均可行。本方法选用90%甲醇为溶剂。 柱切换时间的选择 ThermoFisher IonPac NG1柱为苯乙烯-二乙烯苯键合的反相色谱柱，对疏水性的厄贝沙坦有较强的保留作用，对无机离子不保留。实验发现，将NG1柱与检测器直接相连，以水为流动相，经10min未见厄贝沙坦洗脱，切换为乙腈冲柱，5min内厄贝沙坦洗脱完全，故选用lonPac NG1去除基质厄贝沙坦效果理想。 TAC-ULP1为阴离子交换柱，对阴离子有较强的保留，将TAC-ULP1柱接于NG1柱和检测器之间，以水为流动相，取标准溶液进样后，观察20min， 未见叠氮根离子被洗脱，表明ULP1柱对叠氮根离子的富集能力可行，但富集的时间(即柱切换的时间)有必要进行摸索。 取加标后的样品溶液，照2.3下色谱条件，考察柱切换时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、10.0min时的出峰情况以及叠氮根离子峰面积的变化。柱切换时间在3min内时，溶剂甲醇被带入分析柱中，在保留时间5min附近出现较大的溶剂峰，干扰测定，叠氮根离子峰面积随着柱切换时间的延长而增加；柱切换时间大于4 min后，溶剂甲醇无干扰，叠氮根离子峰面积趋于稳定，故选择柱切换时间为4min。 线性、检出限和重现性 取标准溶液重复进样6针，保留时间的RSD为0.12%，峰面积的RSD为0.61%，表明本方法进样重现性良好。取NaN。适量，加90%甲醇溶解并稀释制成每1mL约含叠氮根0.04、0.10、0.16、0.20、0.24、0.40ug的溶液，作线性考察，峰面积(A)与浓度(C)的线性关系为A= 1.0558 C-0.0157(R=0.9992)。按叠氮根离子限度的50%、100%、150%浓度进行回收率试验，回收率在95.4%~98.9%之间，回收率良好。叠氮根离子的定量限和最低检出限(S/N分别约为10和3)分别为10ng/mL、3ng/mL。 取2个厂家6批样品进行测定，3批样品未检出，其余样品叠氮根离子含量在1~2mg/L(不规范)之间。本方法采用在线基质去除及浓缩柱进样的方法，大大简化了样品的预处理过程，方法简便。随着药品质量控制要求的不断提高，很多在生产工艺中引入的有毒阴、阳离子均要求进行控制，而化学药品多为脂溶性物质，疏水性强，不适合离子色谱的直接进样分析，本文建立的方法可以在药物痕量离子的控制领域广泛应用。 ( [1] 岑均达，马霞.厄贝沙坦的合成[J].中国医药工业 杂志，2007， 38(3)：239 ) ( [2] Bernhart C， Breliere JC. N-Substituedheterocyclic derivatives， t heir preparation andthe pharmaceutical compositions in which t h eyare present. U.S.Patent， 5270317，1993. ) ( [3] USP 35-NF30： 3556 ) ( [4] European Pharmacopeia 7.0：2278 ) ( [5] 叶明立，朱岩，施青红.离子色谱法测定有机 溶剂中痕量阴离子[J].分析化学，2005，33(2)： 187 ) ( [6] 任丹丹，方晓霞，姚超英，等.离子色谱柱切换法测定酒石酸中的痕量阴离子[J].浙江大学学报 (理学版)，2010，37(4)：446 ) ( [7] Vermeiren K . Trace anion determination i n c oncentrated hydrofluoric a cid solutions bytwo-dimensional i on chromatography 1. Matrixelimination by ion-exclusion chromatography.J.of Chromatography A， 2005， 1085： 60 ) ( 8] 3 B runo P . D e termination of nutrients in t he presence o f high chloride concentrations b y column-switching i o n chromatography. J. ofChromatography A， 2003， 1003： 133 ) ( [9 ]M uhammad A， Le e W L， Tunable separation ofanions and cations by column switching in ionchromatography. To y ohide T. T alanta， 2007(71)：1470 ) ( [10] Yuan Huang， S hi-Fen Mou， K e -Na Li u ， e t al. S implified column-switching technology for thedetermination of traces of anions in the presenceof high concentrations of other anions. J. ofChromatography A，2000， 884：60 )