木蝴蝶中黄芩素和白杨黄素检测方案(高速逆流色谱)

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分析化学(FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Joumal of Analytical Chem istry第34卷2006年9月特刊S243~S246 分析化学第34卷244 木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶(Oroxylum indicum (L.) Vent )的干燥成熟种子，是我国常用中草药之一，并被收入中国药典，具有止痛、止咳及清热等作用，用于治疗感冒、支气管炎和其它一些疾病。 黄芩素和白杨黄素为木蝴蝶主要有效成分，具有清热、抗过敏，抗氧化和抗癌等功能。近几年来对木蝴蝶中黄酮类成分的研究非常活跃~41。因此，建立相关成分的高效分离纯化方法具有重要意义。 高速逆流色谱(HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术。它克服了固相载体对样品的吸附损失、变性等缺点，并可以在短时间内实现高效制备性分离，因而在中药有效成分的分离与纯化方面得到了广泛的应用16~11]。本实验应用 HSCCC木木蝴蝶药材中成功地分离纯化出黄芩素和白杨黄素(结构见图1)，经高效液相色谱(HPLC)分析，其纯度分别为99.2%和100%。 图1 黄芩素(R=OH)和白杨黄素(R=H)的化学结构式 ( Fig1 1 Chem ical structure of baicalein(R =OH) and chrysin (R=H) ) 2.1 仪器、试剂与材料 TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)； AKTA prme泵及检测系统(瑞士安玛西亚生物有限公司)；HX-1050恒温器(北京博医康实验义器有限公司)；1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；色谱柱： SpherigelODS Ci (250 mm x4.6 mm， 5 pm)；Mercury plus 400核磁共振仪(美国瓦里安公司)。 粗提物的制备及 HSCCC分离用溶剂(石油醚、乙酸乙酯、甲醇等)均为分析纯(天津化学试剂三厂)。HPLC分析用甲醇为色谱纯(禹城化工厂)，实验用水为二次蒸馏水。 木蝴蝶药材购于聊城市利民大药店，经山东中医药大学张永清教授鉴定为正品药材。 2.2 样品制备 取 100 g于60℃恒重的木蝴蝶药材粉碎，用700mL 70%甲醇回流提取3次(每次2h)，合并提取液，减压蒸馏，得浸膏34.3 g。浸膏加水溶解后用其3倍体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇部分，减压蒸馏回收溶剂，得浸膏16.6 g。此浸膏再用石油醚乙酸乙酯乙醇水(5555，V/V)体系的下相100 mL溶解后，取等体积的上相萃取4次，合并上相部分，减压蒸馏得淡黄绿色粉末(即木蝴蝶药材的粗提物)5.8g，放置冰箱内备用。 ( 2005-09-06收稿；2006-01-28接受 ) 2.3 分配系数的测定 本实验用HPLC测定样品在不同溶剂体系的分配系数。取适量木蝴蝶药材的粗提物于5mL试管中，用预先达到分配平衡的两相溶剂系统的下相将其溶解，用HPLC进行检测，峰面积为A1。然后取等体积的上相加入此溶液，剧烈振荡使其充分混合，待达到分离平衡后，再取下相用HPLC检测，峰面积为A2。分配系数K则按下式计算：K=(A1-A2)/A2。 2.4 两相溶剂系统及样品溶液的制备 本实验所用溶剂系统为石油醚乙酸乙酯甲醇水(5555和5582，V/V)，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分混合，分相平衡后，分出上相和下相，使用前分别用超声波脱气 30min。 取大约300mg木蝴蝶药材粗提物，溶于4mL石油醚乙酸乙酯甲醇水(5555，V/V)上相中，振荡使之完全溶解，以备 HSCCC进样。 2.5 HSCCC分离过程 用 AKTA prme系统将石油醚乙酸乙酯甲醇水(5555，V/V)的上相(固定相)和下相(流动相)以4060的体积比同时泵入 HSCCC螺旋管。当螺旋管完全充满后，仅以 2.0 mL/min的流速泵入流动相，同时将螺旋管转速调为850 r/m in。达到动力学平衡后(大约30min)，将样品通过进样阀注入分离螺旋管。进样80min后，进行梯度洗脱。流动相在50min内由100%的5555体系的下相变为100%的5573体系的下相。分离温度控制在25℃，柱后流出物以紫外检测器检测，检测波长为254mm。色谱图于进样80min开始记录，根据色谱图手动收集各色谱峰组分。 3 结果与讨论 3. 1 高效液相色谱条件的优化 本实验在 HPLC分析木蝴蝶样品粗提物过程中，尝试了用不同比例的甲醇水、甲醇-0.1%磷酸作为流动相，结果表明：当采用甲醇 0.1%磷酸在30min内体积比由4060线性变为77030，流速为1.0mL/min时，粗提物中的主要组分可以得到良好分离(见图2)。 (hrysin 图22 木蝴蝶粗提物和HSCCC峰组分的 HPLC色谱图及黄芩素、白杨黄素紫外光谱图 Fig 2High perfomance liquid chromatogram of crude extractrs and high speed counter-current chromatographic(HSCCC)peak fractions and the ulraviolet spectra of baicalein and chrysin A.粗提物 (crude extracts)； B.黄芩素(baicalein)； C.白杨黄素(chrysin)。 3.2 HSCCC分离条件的优化 应用HSCCC分离纯化天然药物中的活性成分的关键，是合适的两相溶剂系统的选择。溶剂系统合适与否是由目标化合物在其中的分配系数来衡量的。本实验测定了目标化合物在乙酸乙酯水、乙酯乙酯甲醇水、石油醚乙酸乙酯甲醇水等溶剂体系中的分配系数。实验结果表明，当采用乙酸乙酯水、乙酸乙酯甲醇水作为两相溶剂系统进行分离时，难以实现目标化合的的分离；采用石油醚乙酸乙酯-甲醇水为两相溶剂系统时，可以实现目标化合物的分离。目标化合物在不同比例石油醚乙醇乙酯甲醇水体系中的分配系数见表1。由表1可以看出，黄芩素和白杨黄素在体积比为5564、555.54.5和5555三个溶剂系统中均有可能分开。但当应用5555体系作为溶剂系统时，分离白杨黄素所需 差。基于以上情况，实验采用梯度洗脱的方式进行 HSCCC分离纯化。实验结果表明，进样后先以5555体系的下相洗脱 80min.然后流动相在50min内由100%5555体系的下相变为100%5573的下相，可得到较理想的分离效果。 对流动相流速、旋转管转速和分离温度等也进行了优化，结果发现，在流速2mL/m in转速为850 r/min、温度为25℃条件下，分离结果令人满意。 表1 黄芩素和白杨黄素在石油醚乙酸乙酯甲醇水体系中的分配系数 Table 1 Partition coefficients of baicalein and chrysin in light petro-leum-ethyl acetate methanolwater solvent systems 石油醚乙酸乙酯甲醇水 Partition coefficient Light petroleum-ethyl acetate- methanolwater system 黄芩素 白杨黄素 Baicalein Chrysin 5573 0.089 0.30 5564 0.28 0.82 555.54.5 0.55 1. 67 555 5 0.99 3.23 在优化 HSCCC条件下，对木蝴蝶粗提物 进行了HSCCC分离纯化，结果见图3。从300mg木蝴蝶粗提物中一步分离纯化得到 25.5 mg黄芩素和36.6mg白杨黄素，经HPLC分析其纯度分别为99.2%和100%。HPLC色谱图及相应组分的紫外光谱图见图 2(B、C)。 3.3 HSCCC峰组分的鉴定 根据 HNMR和CNMR数据对各峰组分作了鉴定：峰I：HNMR(400MHz，DMSO ) 8： 6.60(1H，s， H-8)，6.90(1H， s， H-3)， 7.6 (3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，8.0(2H，m，H-2'，H-6')，8.45(1H， s，C6 OH)，10.56(1H，s，C，OH)，12.67(1H，s，C，OH)。13CNMR(400 MHz，DMSO) 153.6(C-2)， 104.5(C-3)，182.1(C-4)，149.9(C-5)，129.4(C-6)，163.0(C-7)，94.0(C-8)，147.0(C-9)，104.3(C-10)，131.0(C-1')，126.3(C-2'，C-6')，129.2(C-3'， 图3 木蝴喋粗提物HSCCC色谱图 Fig3 HSCCC chiomatogram of crude extracts C-5')，131.9(C-4')。经与文献[12]数据对照，确定为黄芩素。 峰Ⅱ：'HNMR(400MHz，DM SO) 8： 6.20(1H， d，J=2 Hz，H-6)，6.51(1H， d，J=2 Hz， H-8)， 6.95(1H，sH-3)，7.6(3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，8.0(2H，m，H-2'，H-6')，10.86(1H， s，C，OH)， 12.78(1H， s，C，OH)。CNMR (400MHz，DMSO)8： 163.2(C-2)，105.2(C-3)，181.9(C-4)，161.5(C-5)，99.1(C-6)，164.5(C-7)，94.2(C-8)，157.5(C-9)， 104.0(C-10)，130.7(C-1')，126.4(C-2')，129.2(C-3')， 132.0(C-4')，129.2(C-5')，126.4(C-6')。以上数据和文献[12]对照，确定为白杨黄素。 ( References ) ( Editorial Comm ittee of the Phamacopoeia of People's Republic of China(中华人民共和国卫生部药典委员会编).Th e Pham acopoeia of People's Republic of China (Part Ⅰ)(中华人民共和国药典(一部)). 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C h ron atogr A ， 2 000， (883)：6 7 ~73 ) ( 11 Ma X F， Z hang T Y， Wei Y， Tu P F， Chen YJ， Ito Yoichim J. Chrom ato g r A. ， 2002，962(1~2) ： 243~247 ) ( 12 Xiao L ihe(肖丽和)， W ang Hongyan(王红燕)， Song Shaojiang(宋少江)， Zhang Guangp ing (张广平)， Song Haixiu(宋海 ) ( 秀)， Xu Suixu(徐绥绪). Joumal Shenyang Pham aceutical Un iversity (沈阳药科大学学报)，2003，，20(3)：181~183 ) Isolation and Pur if ica tion of Ba ica le in and Chrysin from the Extracts ofOroxylum Indicum by High Speed Counter-current Chromatography Sun Ailing， Sun Qinghua， Liu Renm in (College of Chen istry and Chen ical Engineering， Liaocheng University， Liaocheng 252059) Abstract High speed counter-current chromatography (HSCCC) was successfully used for the isolation andpurification of baicalein and chrysin from the extracts ofO roxylum indicum using stepwise elution with a pair oftwophase solvents system s composed of light petroleum-ethyl acetate methanolwater (5 5 5 5 and 5 5 7 3，V /V). From 300 mg of the crude extracts， 25.5 mg of baicalein and 36.6 mg of chrysin were obtained with apurity of99.2% and 100%， respectively， as detemm ined by high perfommanceliquidchiomatographyThestructures of the isolated compounds were identified by H-nuclear magneticre sonance (NMR) and CNMR. Keywords High speed counter-current chromatography， O roxylum indicum， baicalein， chrysin ( (Received 6 Sep tember 2005； accep ted 28 January 2006) ) 《微量元素与健康研究》2007年征订启事 《微量元素与健康研究》国内外公开发行的综合性学术刊物，双月刊，创办于1984年。原名《微量元素》，1992年更名为《微量元素与健康研究》，是国内创刊最早的微量元素学科专业期刊。本刊集理论研究、临床应用、预防医学及教学实践经验于一体，内容丰富、信息量大、可读性强。栏目包括了微量元素研究的各行业、各学科与前沿、交叉多学科，全面报道与常量元素、微量元素有关的研究项目、科研动态及新技术、新方法、新成果等。是从事临床、科研、中西医结合、中医中药、预防医学、环保、商检以及医疗保健的广大科技工作者必需的参考工具以及发表研究成果的重要园地。在该领域本刊已成为专业工作者获取我国微量元素情报信息的重要来源，是我国微量元素学科的重点期刊。设置的栏目有：基础研究”“现代医学”、“妇儿疾患与保健”、“中医中药”、“食品营养与食物链”、“调查研究”、“实验技术”、“综述·讲座”、“元素专论”、短篇论著”等。 本刊自2003年起，已由原来的季刊改为双月刊，逢单月30日出刊。2007年订价仍为每期8.00元，全年6期订费为48.00元(含邮资)。全国各地邮局均可订阅。本刊国内统一刊号：CN 52 -1081/R，国际标准刊号：ISSN 1005-5320。邮发代号：66-53。国外发行代号：4813BM。为方便读者订阅，本刊编辑部全年办理邮订业务，遗失补寄。邮局汇款寄"编辑部"收，勿寄个人。 光盘检索：中国学术期刊光盘(医药卫生版)版 邮订地址：贵阳市市东路50号，《微量元素与健康研究》编辑部 邮编：550002 联系电话：(0851)5928845，5616973 Email： wyjk@ chinajoumal net cn wyjk@periodicals net cn 网址： http： //wlysyjkyi periodicals net cn http： //wyjk chinajoumal net cn ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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