淡豆豉中大豆素和染料木素检测方案(高速逆流色谱)

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维普资讯 http：//www.cqvip.com·375·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 37 卷第3期2006年3月 量，对被提取的新棒状花椒酰胺的影响不大，故选择体积流量大一点的因素Cs来提取两面针中新棒状花椒酰胺。因此，用渗漉法提取两面针中新棒状花椒酰胺的最佳工艺条件是AB：Cs，即用95%乙醇溶液，在渗漉柱中以3.9 mL/min 的体积流量流出，提取72h，即可达到两面针中新棒状花椒酰胺提取的最佳工艺效果。 表2 正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal test 试验号 A B C D(误差) 新棒状花椒酰胺提取率/% 1 0.03 2 2 2 0.22 3 3 3 0.46 4 2 3 1 0.72 5 2 3 2 0.34 6 2 2 1 3 0.67 7 3 2 1 0.71 8 3 3 1 2 0.74 9 3 1 2 3 0.35 0.71 0.72 1.44 1.46 1.73 1.60 1.29 1.30 1.80 1.92 1.51 1.48 1.09 1.20 0.22 0.18 表3 方差分析 Table 3 Variance analysis 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性 A 0.25 2 0.13 65.00 P≤0.05 0.25 2 0.13 65.00 P<0.05 0.0059 2 0.0030 1.50 D(误差) 0.0040 2 0.0020 F0.05(2，2)=19.0 Fo.01(2，2)=99.0 2.3 验证试验：取两面针100.0g，用渗漉法在AgBC：条件下提取两面针中的新棒状花椒酰胺，按同样的方法来检测分析提取液中新棒状花椒酰胺，结果提取液中新棒状花椒酰胺的提取率为0.74%， 这与试验8号的ABC结果一致。这可能是只要选择合适的提取溶剂，有足够的浸泡时间让溶剂将两面针中的新棒状花椒酰胺提取完全即可，渗漉速度的快慢对两面针中的新棒状花椒酰胺提取影响不大，所以用渗漉法在 AsB，Cs的条件下与试验8号的AB，C结果都是0.74%。 3讨论 试验研究发现，不同的提取条件，两面针中新棒状花椒酰胺差别很大。当乙醇体积分数为95%、浸泡时间为72h、渗漉体积流量为3.9 mL/min 时，两面针提取液中新棒状花椒酰胺的提取率最高，为0.74%；当乙醇体积分数为50%浸泡时间为24h、渗漉速度为1.3mL/min 时，两面针提取液中新棒状花椒酰胺的提取率最低，为0.031%。 与回流提取法相比，渗漉法提取不需要加热回流，但是乙醇的体积分数要求高一些，时间要长一些，提取率为0.74%；而回流方提取时，要加热回流，乙醇的体积分数要求稍低一些，时间要短一些，提取率为0.76%[2]，稍高一些。通过比较研究发现，这两种提取方法都是切实可行，可以根据具体情况选择合适的提取方法。 ( References： ) ( 1T ] Liu S H， Q in Q Y， Fang K， et al. 1 The preparation o f neoherculin a nd i t i s u sed in the p r oductions o f oral c a vity[P]. CN： 2 005102000806.2005-02-05. ) ( 21 ] Liu SH， Qin Q Y， Fang K， et al. Extraction of neoherculin from Zanthoxylum n itidum (Roxb.) DC [J]. N a t Prod Re s Devel(天然产物研究与开发)，2005，17(4)：482-484. ) ( [3] Liu S H ， Qin Q Y， Ta n g X L， e t a l. De t ermination of theneoherculin of Zanthorylum nitidum (Roxb.) DC growing in the ten areas of Guangxi [J]. Nat Prod Res Devel(天然产物 研究与开发)，2005，17(3)：337-339. ) 高速逆流色谱法分离制备淡豆豉中大豆素和染料木素 曲丽萍，宓鹤鸣*，范国荣，位 华，孙 亮 (第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433) 淡豆豉是经大豆 Glycine max (L.) Merr. 发酵而来的传统中药，其中所含的大豆异黄酮是该药主要活性成分之一。近年来的研究结果表明，大豆异黄酮是一类重要的生理活性物质，具有预防心血管 疾病、防癌抗癌、治疗骨质疏松、降低妇女更年期综合症1~3]等功效。经发酵处理后大豆异黄酮中游离型苷元的质量分数明显提高，如大豆素和染料木素，而游离型大豆异黄酮比结合型大豆异黄酮具有更强 ( 收稿日期：2005-05-17 ) ( 基金项目：上海市科委基金资助项目(02DZ19111) ) ( *通讯作者 宓鹤鸣 Tel： ( 021)25074436 E -mail： mixiao0519@msn. com ) 的生物活性。因此，如何简便、快速从淡豆豉中分离制备大豆异黄酮苷元对进一步进行药效与作用机制研究、开发现代中药和充分利用我国的药材资源等具有重大意义。高速逆流色谱(high-speedcounter-current chromatography， HSCCC)法是一种不需固态载体的液液分配色谱技术，该技术与传统方法比较具有分离效率高、操作简便、可避免因不可逆吸附而引起的样品损失等无可比拟的优点，因此已被广泛应用于天然产物有效成分的分离制备当中[5]。本实验采用高速逆流色谱技术从淡豆豉中分离制备大豆素和染料木素，优选了最佳的溶剂系统，该法分离时间短、产物纯度高。 实验部分 1.1 仪器：TBE—300A 高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司)，聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积 300mL)，20 mL 进样圈，该 HSCCC 还配备了柱塞式泵(S系列，北京圣益通技术开发有限公司)，UV一I型检测器(中国科学院上海生物化学研究所)，N2010色谱工站站(浙江大学智能信息工程研究所)。 Waters 高效液相色谱仪，包括515泵，2487检测器，20 pL定量圈，N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)。 1.2 材料与试剂：淡豆豉购于上海童涵春中药饮片厂。大豆素和染料木素对照品购于上海同田生化技术有限公司，质量分数均大于99%。实验中所用的氯仿、甲醇、石油醚为分析纯，乙腈为色谱纯，购于上海市化学试剂公司。水为自制重蒸馏水，并经微孔滤膜滤过。 1.3 淡豆豉中大豆异黄酮粗品的分离：将药材适当粉粹，称取粗粉2kg，先用石油醚于索氏提取器中回流提取8h除去脂肪油后，加8倍量75%乙醇，回流提取2次，每次2.0h。滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏。取浸膏加适量水混悬后，过1300大孔吸附树脂，依次用水、40%乙醇和75%乙醇洗脱，将75%乙醇洗脱流份减压浓缩后真空干燥得黄色粉末，置冰箱保存，备用。 1.4 溶剂体系选择：在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-水(4：3：2)溶剂体系，充分振摇后静止，使用前分取上下相，超声脱气后泵入逆流色谱仪。先将色谱柱中充满上相作为固定相，调整主机转速为800r/min，再以 2.0 mL/min 体积流量泵下下相作为流动相，待流动相从柱出口流出，表明两相在分离管中建立了动态平衡，由进样阀进样，流出液采用紫外检测 器在 254 nm 处进行检测，同时记录色谱图，根据色谱图接收目标成分，并检测色谱峰纯度。 1.5 液相色谱条件：色谱柱： Lichrospher C18柱(150mm×6.0 mm， 5 um)(江苏，汉邦科技有限公司)，流动相为乙腈-水-冰醋酸(45：55：2)，体积流量为1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温为室温，进样量20pL。 2 结果与讨论 淡豆豉经石油醚除油后，过1300大孔树脂易于得到较为干净的总异黄酮粗提物。实验中用不同体积分数乙醇梯度洗脱，各流份经高效液相色谱法检测，与对照品比较表明：大豆异黄酮苷元主要存在75%乙醇洗脱物中(图1)，其结合型糖苷主要存在40%乙醇洗脱物中。本研究中接收75%乙醇洗脱物减压浓缩后真空空燥(60℃)，得浅黄色粉末2.14g，得率为1.07%。 1-大豆素 2-染料木素1-daidzein 2-genistein 图1 淡豆豉粗提物时高效液相色谱图 Fig.1 HPLC Chromatogram of crude extractfrom Semen Sojae Preparatum 高速逆流色谱法中，分离成败的关键在于能否选择合适的两相溶剂系统。合适的两相溶剂体系应满足下列要求：分层时间短于30s；固定相的保留率要高；目标化合物的两相中的分配系数应合适(0.5 关闭