黄连、黄柏、十大功劳和金果榄等中药中生物碱检测方案(高速逆流色谱)

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浙江工业大学学报JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITYOF TECHNOLOGYVo1.34 No.1Feb.2006第34卷第1期2006年2月 浙江工业大学：学报第34卷·60 制备型高速逆流色谱分离中药中的生物碱 褚建军，颜继忠 (浙江工业大学药学院，浙江杭州310032) 摘要：高速逆流色谱分离生物碱是目前中药有效成分分离中的热点，本文用制备型高速逆流色谱，从黄连、黄柏、十大功劳和金果榄等四种中药中分离出了几种小檗碱类生物碱.分离的基本方法都是把中药材进行粉碎，然后用工业酒精浸泡，滤液浓缩后用浓盐酸酸化过滤，滤液用氢氧化钠碱化至pH=10后用氯仿萃取，氯仿萃取液浓缩所得浸膏作为分离的样品.分离的溶剂体系主要由四氯化碳、氯仿、甲醇和稀盐酸以不同的体积比组成，分离条件是流速为2mL/min，转速为800 r/ min，进样量为200 mg.分离所得组分用标准品进行对照，确定结构. 关键词：制备型高速逆流色谱；生物碱；黄连；黄柏；十大功劳；金果榄 中图分类号：R937.1 文献标识码：A 文章编号：1006-4303(2005)06-0059-03 The separation of alkaloids using preparative high speedcountercurrent chromatography from chinese herbs CHU Jian-jun，YANJi-zhong (College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310032 ，China) Abstract ： The separation of alkaloids using high speed countercurrent chromatography is a common methods which is often taken by people. In this paper we used preparative high speed coun-tercurrent chromatography to separate alkaloids such as berberine ed al. from coptis chinensisfranch ，phellodendron chinense schneid. ，tinospora capillipes gagnep and mabonia bealei (Fort)carr. The general methods to separate is that all chinese herbs is pulverized and soaked with etha-nol， then condensed and the filtrate is acidified with hydrochloric acid. Then adjust p H to 10 withsodium hydroxyl and extracted with chloroform. The condensed sample is separated with highspeed countercurrent chromatography. The solvent system is mainly composed of tetrachloride，chloroform，methanol and dilute hydrochloric acid.TThe flow-rate is 2.0 mL/min， the revolutionspeed is 800 r/ min and the sample size 200 mg. The separated fractions are identified with stand-ard samples. Key words ： preparative high speed countercurrent chromatography； alkaloid； coptis chinensisfranch ；phellodendron chinense schneid.；tino spora capillipes gagnep；mabonia bealei(Fort)carr ( 收稿日期：2005-03-03 ) ( 作者简介：褚建军(1975-)，男，浙江龙泉人，硕士，主要从事中药有效成分的提取和分离研究. ) 0 引 言 高速逆流色谱制备分离中药中的有效成分，因其能在短时间内实现高效分离和制备，已成为中药中有效成分制备分离的热点.而小檗碱类生物碱，如小檗碱、巴马亭、黄连碱等，因其结构相近、药理作用明显而受关注.本文用高速逆流色谱技术，制备分离了黄连、黄柏、十大功劳、金果榄中的小檗碱类生物碱. 实验部分 1.1 仪器与试剂 HSCCC- TBE300 型高速逆流色谱仪，深圳同田生化有限公司. HD-21-C-B核酸蛋白检测仪，上海康华生化仪器厂. R-201旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司. LC-10AT高效液相色谱仪，日本岛津色谱仪器公司. 四氯化碳、氯仿、甲醇、正丁醇、乙酸均为国产分析纯，水为重蒸水，黄连、黄柏、十大功劳、金果榄购于杭州胡庆余堂. 1.2 样品的处理 把4种中药各1000g粉碎到20目，分别用工业酒精浸泡24h，连续3次，过滤，合并滤液浓缩后加适量盐酸酸化至pH=2，放置过夜，过滤的滤液再用NaOH碱化至pH=10，然后用氯仿萃取数次，氯仿浓缩得浸膏，该浸膏用于高速逆流色谱分离的样品. 1.3 HSCCC溶剂系统选择 溶剂系统以文献[1]中氯仿：：甲醇：0.1mol/L稀盐酸组成最初的溶剂体系，按照各种比例混合，总体积为4mL，每次取样品10 mg 溶于溶剂体系，充分溶解后分层，取上下相分别点板(硅胶板，展开剂为：正丁醇：甲酸：：水=7：：1：2)，看两相中斑点的大小，最后发现当氯仿、甲醇、水的体积比为2：1 ：1时，斑点大小大约相等，所以选氯仿 ：甲醇：0.2mol/L稀盐酸=2：11：：1为基本的溶剂体系，在分离时，针对不同的中药，添加适量的四氯化碳或改变溶剂的比例，组成各种溶剂体系对各种中药进行分离. 1.4 结构鉴定 文中经分离所得各组分用 HPLC 进行纯度测 定，并用对照品进行比较，对照品购于中国生物制品药品鉴定所. 2 分离结果 2.1 黄连中生物碱的分离 黄连为毛鼓科植物黄连Coptis chinensisFranch.，三角叶黄连C. deltoidea C. Y. ChengetHsiao 或云连 C. teeta Wall.的干燥根茎，主要成分为多种生物碱，包括小檗碱(berberine)，黄连碱(coptisine)，甲基黄连碱(worenine)，巴马亭(pal-matine)，药根碱(jatrorrhizine)和表小檗碱(epiberberine)[2]. 溶剂体系为氯仿：甲醇：0.1mol/L稀盐酸=2：111：1，分离条件为进样量200 mg 溶于20 mL的溶剂系统上相，流动相流速2mL/min，仪器转速800 r/min，检测器波长254nm，进样时间4h.保留率为73.3%. 分离结果如图1.我们用自动部分收集器进行收集，间隔时间为6min.由HPLC检测结果对照标准品后知组分Ⅰ为巴马亭(50.9 mg)，组分Ⅱ为小檗碱(71.1mg)，组分Ⅲ为表小檗碱(14.8mg)，组分Ⅳ为黄连碱(25.6 mg)，组分V为未知物(7.2 mg). 图1 黄连中生物碱分离的高速逆流色谱图 2.2 黄柏中生物碱的分离 黄柏为植物黄皮树及其变种的干燥树皮，主要成分为多种生物碱，包括小檗碱(berberine)，巴马亭(palmatine) 和药根碱(jatrorrhizine)等3].主要产地为四川、贵州、湖北和云南.黄柏的功用为清热、泻火、解毒.主治热痢、泄泻、消渴、黄疸梦梦、淋林、痔疮、便血、赤白带下、骨蒸劳热、目赤肿痛、口舌生疮、疮肠肿痛. ：溶剂体系为：氯仿：甲醇：0.2 mol/L稀盐酸=2：1：1，将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积1000mL)，分离步骤和条件同黄连，进样4h后，停止主机转动，用氮气把固定相推 出，测得保留比为71.4%.分离结果如图2，图中组分Ⅰ为巴马亭(20.4 mg)且分Ⅱ为小檗碱(64.8mg)，组分ⅢI为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸. 图2 黄柏中生物碱分离的高速逆流色谱图 2.3 十大功劳茎中生物碱的分离 十大功劳的叶称十大功劳叶，又名功劳叶，味苦，性寒，入肺、肝、肾经，功能清虚热、燥湿、解毒.用治肺癌喀血、骨蒸潮热、头晕耳鸣，腰膝酸软，湿热黄，风热感冒，目赤肿痛，带下，痢疾，痈肿疮疡.十大功劳茎功能清热、燥湿、解毒，主治肺热、咳嗽、肠炎、痢疾、疮疡湿疹等4] 溶剂体系为：四氯化碳 ：氯仿 ：甲醇0.2 mol/L稀盐酸=1：：3：：2：2，将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积2000mL)，分离步骤和条件同黄连，进样4h后，停止主机转动，用氮气把固定相推出，测得保留比为71.2%.分离结果如图3，图中组分Ⅰ为巴马亭(10.8mg)，组分I 为小檗碱(85.9mg). 图3 十大功劳中生物碱分离的高速逆流色谱图 2.4 金果榄中生物碱的分离 金果榄为防己科植物青牛胆 Tinospora sagittata(Oliv.) Gagnep 或金果榄 Tinospora capillipes Gag-nep 的干燥块茎，其化学成分主要是巴马亭、药根碱等.其味苦、寒，具有清热解毒，利咽止痛等功效，用于咽喉肿痛、痱疽疗毒、泄泻、脘腹热痛等. 溶剂体系为氯仿：甲醇：0.2 mol/L稀盐酸=2：：1：：1，将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置 分层(总体积1000 mL)，分离步骤和条件同黄连，进样2h后，停止主机转动，用氮气把固定相推出，测得保留比为72.3%. 经高速逆流色谱分离后显示有两个主要的峰(见图4)，我们用自动收集器进行部分收集，间隔时间为6 min，并用 TLC进行检测，去掉组分重叠的试管.结果得到的组分II(图中第二个峰)，经 HPLC检测组分I的纯度大于99%.组分I为一混合物，组分I为巴马亭(16.8 mg). 图4 金果榄中生物分离的高速逆流色谱图 3 结 论 制备型高速逆流色谱分离中药中的小檗碱类生物碱，采用氯仿：甲醇：水的相近体系，以有机相为移动相，水相为固定相，在转速为800 r/ min ，流速为2mL/min的分离条件下，均能够在短时间内一次性分离出纯的单体生物碱，并且进样量可以达到200 mg，故氯仿 ：甲醇：水体系，是分离中药中小檗碱类化合物的良好体系. ( 参考文献： ) ( [1] YANGFQ，ZHANGTY，ZHANGR， et al. Application of analytical and preparative high speed c ounter current chroma-tography f or s eparation o f alkaloids f rom C o ptis chinensisFranch[J ] . 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