杜梨果实中多糖提取方法及含量检测方案(微波萃取仪)

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西北农业学报 2007，16(4)：279~281Acta Agriculturae Boreali-occi dentalis Sinica 16卷西 北 农 业 学 报·280 杜梨果实多糖提取方法及含量测定的研究 赵小亮，白红进，汪河滨，周忠波，罗 锋 (塔里木大学，新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔 843300) 摘 要：分别采用超声波-微波协同萃取、微波、水浴及超声波4种方法提取杜梨果实多糖，用蒽酮-硫酸比色法测定多糖的含量。结果表明，4种提取方法存在明显的差异，以超声波-微波协同萃取效果最佳，其后依次是微波、水浴及超声波。4种方法提取下多糖的含量分别为13.91%13.56%、12.74%和11.06%，葡萄糖浓度在25.15~100.6pg·mL范围内呈现良好的线性关系，平均回收率为100.5%，RSD 为1.59%(n=5)。超声-微波协同萃取提取杜梨果实多糖的方法优于微波、水浴及超声波法提取，蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量的方法准确，重复性好。 关键词：杜梨果实；多糖；超声波-微波协同萃取；微波；超声波；含量测定 中图分类号：Q946.3 文献标识码：A 文章编号：1004-1389(2007)04-0279-03 Study on the Extraction Methods and Content Mea surement ofPolysaccharide from Pyrus betulaefolia Bunge Fruit ZHAO Xiao-liang，BAI Hong jin，WANG He-bin，ZHOU Zhong-bo and LUO Feng (Tarim University， Xinjiang Production & Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of BiologicalResources in Tarim Basin ，Alar Xinjiang843300，China) Abstract ： Ultrasonic-microwave synergistic ， microwave， water bath and ultrasonic extraction wereemployed to extract the polysaccharide and anthrone sulphuric acid colorimetry was used to determineits content. There exist remarkably differences among the four methods； ultrasonic-microwave syner-gistic extraction is the optimal method，then the microwave， water bath and ultrasonic extraction fol-lowing it. The polysaccharide content of the four methods is 13.91 %，13.56%，12.74% and 11.06%respectively. The linear range was 25. 15~100.6 ug ·mL for glucose. The average recovery rates100.5% (RSD 1.59%，n=5). The ultrasonic- microwave synergistic extraction is the best extractionmethod. The method of anthrone sulphuric acid colorimetry determine the polysaccharide content wasstable ，accurate. Key words ： The fruits of Pyrus betulaefolia Bunge ；Polysaccharide；Ultrasonic-micro wave synergisticextraction；Ultraso nic ；Microwave；Content determination 杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge) 属蔷薇科(Rosaceae) 梨属(Pyrus L.)乔木，药用称棠梨，主治功用为敛肺涩肠、止咳止痢。常用于治疗久咳、久泻、久痢等。《本草纲目》记载载梨(即杜梨)“味酸、甘、涩、寒；无毒。烧熟食用，可治泄泻痢疾”。2根据文献检索，目前杜梨主要作为砧木木园 林树种以及重要的木材来源广泛分布在我国的北部、东北部和中部各省(区)，以黄河流域分布较多。关于杜梨的研究主要集中在种子萌发与幼苗生长的研究、幼苗根系生长状况的研究，作为砧木嫁接梨树等方面，对于杜梨果实多糖的提取及含量测定方面的研究还未见相关报道。自20世 ( * 收 稿日期：2006-12-05 修回日期：2006-12-27 ) ( 基金项目：新疆维吾尔自治区高等学校科学研究计划资助项目(No. XJEDU2005 G07)；塔里木大学校长青年基金资助项目(No TDZKQN06003)。 ) ( 作者简介：赵小亮(1982-)，男，甘肃灵台人，助教，主要研究方向为资源植物化学。E-mail ：zhx1819 @163. com ) 纪70年代以后陆续发现多糖在增强机体免疫功能及抗肿瘤、抗肝炎、抗溃疡、调血脂、降血糖、抗衰老方面有作用3~4]。本试验采用超声波-微波协同萃取、微波水浴及超声波4种方法提取杜梨果实多糖，并用蒽酮-硫酸比色法测定了多糖的含量。 1 材料、仪器及药品 1.1 试验材料 试验用杜梨于2005年11月采自新疆塔里木盆地，经塔里木大学植物科技学院李志军教授鉴定为蔷薇科植物杜梨( PyrusSbetulaefoliaBunge)的果实，自然风干，去除种子及果柄，粉碎后过40目筛备用。 1.2 试验仪器与试药 SartoriusB S210S 电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)，T6-紫外可见分光光度计(北京普析通用有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏实验仪器设备有限公司)，CW-2000型超声-微波协同萃取仪(上海新拓微波溶样测试有限公司)，RE52-99型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SK3200LH超声波清洗器(上海科导超声波仪器有限公司)，WTS03-1型微波提取设备(中国南京杰金微波设备有限公司制造)，1-15K型高速冷冻离心机(德国 Sigma 公司)，HH-S型恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)，索氏提取器，其他常规玻璃仪器。 所用试剂为葡萄糖，蒽酮，95%乙醇，无水乙醇，丙酮，乙醚，浓硫酸等均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 多糖的提取与精制 称取过40目筛杜梨果实干燥粉末一定量，置索氏提取器中，加入95%乙醇回流提取，去除色素及脂溶性杂质，残渣室温挥干乙醇。取此干粉10g，3份，加入蒸馏水100mL，在80℃水浴中提取30 min，过滤，滤渣采用同法再提取一次，合并两次滤液及洗涤液，定容至200mL容量瓶中。采用同样的方法分别用超声·微波协同萃取、微波及超声波法提取，4种方法提取所得提取液，一部分作为供试样品，用于测定含量，其余减压浓缩到约50mL，冷却后搅拌下加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，4000 r/ min 条件下离心20 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮及乙醚多次洗涤，后在60℃真空干燥箱中干燥，得精制杜梨果 2.2 多糖含量的测定 2.2.1 蒽酮-硫酸溶液的配制 精密称取0.3067g蒽酮，缓慢加入浓硫酸完全溶解后转移至100 mL 棕色容量瓶中定容，得3.067 mg/mL蒽酮-硫酸溶液，现配现用。 2.2.2 最大吸收波长的选择 精密吸取一定浓度的样品溶液1mL加入具塞试管，加入4.00mL蒽酮-硫酸溶液，摇匀后迅速浸于冰水浴中冷却，后浸于沸水浴中，盖上塞，自水浴重新煮沸起，准确煮沸7 min 后立即取出，用自来水冷令10min 后于520~720nm波长范围内测定吸光度，确定了其最大吸收波长为620nm。 2.2.3 标准曲线的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100.6 mg，置100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容，得1.006 mg/mL 莆萄糖标准溶液。分别移取2.50 mL 、5.00 mL、7.50 mL、10.00 mL 的标准溶液置100mL容量瓶中。量取1mL系列标准溶液于具塞试管中，以1mL蒸馏水作空白，分别加入4mL 蒽酮-硫酸溶液，立即摇匀，置冰水浴中，冷却后一起置于沸水浴，盖上塞，自再次沸腾加热7 min，之后在流水放置10 min 冷至室温后，于620nm处测定吸光度值61，以葡萄糖浓度(C)对其吸光度(A)作回归处理，得回归方程：A=0.006C+0.0054，r=0.9996(n=4)。葡萄糖浓度在25.15~100.6ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。 2.2.4 显色时间的考察 取1.006 mg/mL 葡萄糖标准溶液及样品溶液按标准曲线制备项下的方法测其吸光度，每隔20 min 测定1次，结果表明，标准溶液及样品溶液显色时间一致，且在2h内稳定。 2.2.5 换算因子的测定 精密称取2.1中水浴法提取干燥至恒重的杜梨果实多糖精制品13.2mg23.4 mg两份，置100mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解定容，摇匀。精密量取1mL，照标准曲线制备项下的方法操作，测定620nm处的吸光度，根据线性回归曲线方程求出质量浓度，代入f=W/(C·D)，式中W为多糖质量mg，C为多糖质量浓度(mg/mL)，D为多糖稀释因素，计算换算因子17~8]，求得f分别为0.5200和0.5243，取其平均值0.5222。 2.2.6 回收率试验 精密称取处理过的杜梨果实粉末10g，加入适量杜梨果实多糖精制品及 100 mL蒸馏水，80℃下采用超声波-微波协同萃取提取2次，每次30 min，合并提取液、滤液及洗涤液，定容到200 mL，从中量取1mL，照2.2.3的方法操作，显色，测定，计算回收率。结果平均回收率为100.5%，RSD 为1.59%(n=5)。 2.2.7 不同方法提取杜梨果实多糖的测定 精 密量取2.1项下多糖供试样品液各1mL，照2.2.3的方法操作，显色，测定。按下式计算多糖含量。多糖的质量分数及方差分析结果见表1. 多糖含量(%)=C·D·f/W ×100，式中C为多糖质量浓度(mg/mL)，D为多糖稀释因素，f为换算因子，W为样品质量(mg) 表1 不同的提取方法下杜梨果实多糖质量分数及方差分析结果 Table 1 The polysaccharide content under different extraction methods ofPyrus betulaefolia Bunge fruit and the results of variance analysis 提取方法 测定次数/% Measurement time 平均含量/% The average RSD 差异显著性 Significant difference Extraction method 1 2 3 content /% α=0.05 α=0.01 超声-微波协同萃取 Ultrasonic microwave synergistic 14.05 13.94 13.74 13.91 1.13 a A 微波 Microwave 13.70 13.59 13.40 13.56 1.12 b A 水浴 Water bath extraction 12.87 12.77 12.59 12.74 1.11 c B 超声波 Ultrasonic_ 1117 11.08 10.92 11.06 1.15 d C 从表1可以看出，4种提取方法中以超声-微波协同萃取效果最好，高出超声波提取的2.85%，其后依次是微波、水浴及超声波法，但4种方法提取下多糖的含量均高于10%，可见杜梨果实多糖含量丰富。同时从方差分析结果可以看看，4种提取方法之间存在明显的差异，因此，选择不同的试验方法对于多糖的提取影响较大，可根据实际的实验条件进行选择。 3 讨论 3.1 蒽酮-硫酸比色法是测定多糖、单糖含量的常用方法之一，色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。本试验先用乙醇回流提取，除去其中的单糖、双糖、低聚糖、生物碱、氨基酸及醇溶性蛋白质等成分，而后采用水提取其中的可溶性多糖。糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，显色与多糖含量呈线性关系。本研究表明此法简便，供试样在2h内显色稳定，重显性好。 3.2 传统提取多糖多采用热水浸提，也有用超声波、微波等现代技术辅助提取。本研究比较了传统水浴提取、超声波提取、微波提取与超声-微波协同萃取法4种方法，结果表明，4种方法存在明显的差异。超声-微波协同萃取法使样品介质内各点受到的作用一致，降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂的过程，提取效果最好，并且具有高效节能的优点。微波较水浴、超声波提取也具有明显的优势，因此，推测在杜梨多糖提取过程中微波发挥了重要的作用。超 声波提取过程中温度上升较慢，不利于可溶性多糖的提取，可见温度也是多糖提取中重要的影响因素。关于微波提取时的功率、时间以及多糖提取温度等条件还需作进一步的探索。 3.3 通过杜梨果实多糖的含量测定，结果表明杜梨果实多糖含量丰富，这与塔里木盆地日照时间长，昼夜温差大，有利于糖类等化合物的积累有很重要的关系。杜梨结果率高，分布面积广泛，耐旱、耐碱，容易存活，口感独特，多糖的生理活性近年来受到人们的关注，因此，杜梨果实有望用于食品、药品、保健品等行业，具有很好的应用和开发前景。 ( 参考文献： ) ( [1] ] 刘孟军主编.中国野生果树[M].北京：中国农业出版社， 1999.216~217. ) ( [2] 李时珍著.本草纲目(校实本·下册)[M].北京：人民卫生出版社，2003.1766~1767. ) ( [3] Kumazawa Y ，Mizunoe K ，Otsuka Y . 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