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第26卷第6期2007年11月Vol.26 No.6914~917分析测试学报FENXICESHIXUEBAO (Joumal of Instrumental Analysis) 915丁翔宇等:阿德福韦酯及其有关物质的胶束电动毛细管色谱法快速测定第6期 阿德福韦酯及其有关物质的胶束电动毛细管色谱法快速测定 丁翔宇,蒋 晔,李艳荣,郝 福 (河北医科大学 药学院,河北 石家庄 050017) 摘 要:采用胶束电动毛细管色谱法对阿德福韦酯及其有关物质进行了快速分离与测定,并对电泳条件进行了优化。在优化条件下,阿德福韦酯及其有关物质在12min内得到良好的分离,阿德福韦与阿德福韦酯在质量浓度分别为6.28×102~4.02g.L5 6.19 ×10-2~3.96g.L'的范围内与峰面积呈良好的线性关系,加标回收率分别为100%~101%和98%~101%,检出限分别为0.3、0.5mg.L。该方法简单、快速,适用于阿德福韦酯及其有关物质的常规检查和该药的质量控制。 关键词:胶束电动毛细管色谱法;阿德福韦酯;阿德福韦;降解产物 中图分类号:0614.31;U412.6 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2007)06-0914-04 Rap id Detem ination of A defovir D ip ivoxil and Its Related SubstancesbyM icellar Electrokinetic Chromatography D NG Xiang-yu, JIANGYe, LI Yan-rong, HAO Fu (Institute of Phamacy, HebeiMedical University, Shijiazhuangg0050017, China) Abstract A rap id and simple method for the detemm ination of adefovir dipivoxil and its related sub-stances by micellar electrokinetic chromatography was developed Under op tim ized conditions, adefovirdip ivoxil and its related substances were separated within 12 min The linear range of the calibrationcurve for IMEA was 6.28 ×102-4.02g·L'with a detection lim it of 0. 3 mg·L and that foradefovir dip ivoxil was 6. 19 ×102-3.96g·Lwith a detection lm it of0. 5 mg.L. 1The averagerecovery ranges of IMEA and adefovir dip ivoxil were 100%-101% and 98%-101% respectivelyThemethod can be applied to routine checking and quality control of adefovir dip ivoxil and its related sub-stances Key words::micellar electrokinetic chromatography; adefovir dip ivoxil; adefovir(IMEA); Degrada-tion prducts 阿德福韦酯(adefovir dip ivoxil, bis-POM -PMEA)是核转类病毒逆转录酶抑制剂,其化学名为9-[2-[双(特酰酰羟甲氧基)膦酰甲氧基]乙基腺嘌呤,用于治疗慢性乙型肝炎。阿德福韦酯易发生水解生成阿德福韦单酯(mono-POM-PMEA)及阿德福韦(PMEA)(见图1),降低生物利用度。因此检查及控制该药在生产过程与贮存过程中的降解产物,对药品安全有效十分重要。由于阿德福韦酯及单酯与 阿德福韦极性相差较大,在Ci8色谱柱上的保留行为相差甚远,因此在同一色谱条件下难以同时分离、 检测。目前采用C色谱柱仅可测定制剂中阿德福韦酯的含量或体内阿德福韦的浓度12-5],而阿德福韦酯及其降解产物的检查则采用薄层色谱法[6]、离子对色谱法梯度洗脱17-8]、Alltech混合式阴离子交换柱梯度洗脱11,9]、氰基柱等色谱方法110]。采用薄层色谱法仅为限量检查,而 HPLC法梯度洗脱费时,溶剂消耗大。本文建立了简单、快速、经济的胶束电动毛细管色谱同时分离、测定阿德福韦酯及其降解产物的方法,样品分析结果与 HPLC法结果相当,可用于阿德福韦酯开发、生产及贮藏过程中的质量控制及常规检测。 图1阿德福韦酯及其降解产物结构式 Fig.1 Structures of adefovir dip ivoxil andits degradation products ( 收稿日期:2006-09-29;修回日期:2007-01-24 ) ( 作者简介:丁翔宇(1981-),女,河北唐山人,硕士研究生;通讯作者:蒋 晔, Tel: 0311-86265623, E - mail: ji a ngye@hebmu. edu. c n ) 实验部分 1.1 仪器与试药 毛细管电泳配紫外检测器(北京彩陆科学仪器有限公司),高效液相色谱仪配 SP-8810高压泵,SP-8450紫外检测器(美国光谱物理公司),CT22色谱信号采集器(南京千谱软件公司)。 乙腈为色谱纯,硼砂、硼酸、十二烷基硫酸钠(SDS)为分析纯,水为重蒸水,阿德福韦酯、阿德福韦对照品(用非水酸碱电位滴定法测定其纯度分别为99.6%,99.7%),阿德福韦酯制剂的3批样品均由河北医科大学制药厂提供(批号为20050412,20050415,20050422)。 1.2 实验条件 1.2.1 胶束电动毛细管色谱法 石英毛细管50 am X50 um(河北永年光导纤维厂);运行电压16 kV,运行电流8~10uA;进样电压2kV,进样时间10s;柱温:室温;紫外检测波长260 mm. 运行溶液:: pH8.9的 0.05 mol·L硼砂缓冲溶液,内含 0.01mol·L的 SDS和体积分数为20%的乙腈。 开机后用0.1mol·L 的氢氧化钠溶液冲洗 10min, 水冲洗 5min,运行缓冲液冲洗 5min, 每次进样前分别用用氧化钠、水、缓冲液各冲洗 3m in。 1.2.2高效液相色谱 色谱柱: nertsil CN-3高效液相色谱柱(迪马公司,4.6 mm ×250 mm,5um);流动相:乙腈-0.025 mol·LKH, PO4水溶液(用磷酸调 pH 4.0)(体积比为33 :67);检测波长:260 mm;流速: 1.0mL·min1;进样量:20uL。 1.3 溶液配制 阿德福韦酯与阿德福韦对照溶液::分别精密称取阿德福韦酯与阿德福韦对照品各约25mg至10 mL容量瓶中,用运行缓冲液溶解定容,摇匀。再分别取2mL至10mL容量瓶中,用运行缓冲液稀释定容。 阿德福韦酯样品的强化分解:取取德福韦酯样品适量,加入pH 10的硼砂缓冲溶液,于60℃保温,用毛细管电泳检测水解产物,待样品溶液中同时含有阿德福福酯、阿德福韦单酯、阿德福韦时,停止保温,作为待测样品。 1.4 样品处理 取本品20片,研细,精密称取细粉适量(相当于阿德福韦酯 25mg),至10 mL容量瓶中,用运行缓冲液溶解定容,摇匀,过滤。取续滤液2mL至10mL容量瓶中,用运行缓冲液稀释,摇匀,作为供试品溶液。 2 结果与讨论 2.1 色谱行为 在上述条件下,阿德福韦酯、阿德福韦单酯、阿德福韦的色谱行为见图2,由图2可以看出,3者均达到基线分离。 2.2 电泳条件的优化 2.2.1 缓冲溶液的种类 本实验考查了磷酸缓冲溶液(0.05mol·L, pH6.0)、醋酸缓冲溶液(0.05mol·L, pH5.0)、柠檬酸缓冲溶液(0.02 mol/L,pH 5.0)及硼砂缓冲溶液(0.05mo1·L,pH 8.9)对阿德福韦酯降解样品的分离情况,实验结果表明:当使用柠檬酸、磷酸与醋酸缓冲溶液时,阿德福韦峰形不对称;而采用硼砂缓冲溶液三者峰形对称性 图2阿德福韦酯(1)、阿德福韦单酯(2)、阿德福韦(3)图谱 Fig.2 Electropherograms of (1) adefovir dip ivoxil,(2)mono-POM-PMEA and (3) PMEA a 阿德福韦酯与阿德福韦对照品(reference substance ofadefovir dip ivoxil and PMEA); b. 阿德福韦酯供试品 ( tablet sample);c 阿德福韦酯强化分解样品(degradation sample) 良好,且分离时间短。因此本实验选用硼砂缓冲溶液作为电解质溶液。 ( 2.2.2 缓冲溶液的 pH阿德福韦结构中含有可电离的氨基和两个膦酸基团,为两性化合物,在弱碱 ) 条件下,氨基电离受到抑制,而膦酸基团能够发生二级电离。在 pH 7.5~9.0范围内,当硼砂缓冲溶液浓度为 0.05mol·L、SDS浓度为0.01mol·L、乙腈的体积分数为20%时,随着 pH的增加,膦酸基团电离增加,因而其迁移时间随缓冲溶液 pH的增加而增加。阿德福韦单酯仅含1个膦酸基团,所带电荷较阿德福韦少,解离度小,电泳速度慢。但由于负离子淌度与电渗流相反,所以其出峰时间较阿德福韦提前。阿德福韦酯结构中没有可电离的膦酸基团,在弱碱条件下,氨基电离受到抑制,在胶束作用下其迁移时间随 pH的增加而增加。但若缓冲溶液 pH<8.9,阿德福韦单酯、阿德福韦产生拖尾,考虑到在碱性条件下阿德福韦单酯水解的可能及峰的对称性及迁移时间,本文使用 pH 8.9的缓冲溶液。 2.2.3 缓冲溶液的浓度 在其它条件固定的情况下,试验了缓冲溶液的浓度对阿德福韦酯及其降解产物迁移时间的影响。阿德福韦酯、阿德福韦单酯及阿德福韦的迁移时间随缓冲溶液浓度的增加先减小后增加,当缓冲溶液浓度在 0.025~0.05 mol·L 之间时,3者迁移时间达到恒定。缓冲溶液浓度较低时(0.005 mol·L),电渗流较小,迁移速度慢;当缓冲溶液浓度大于 0.05mol·L时,随着浓度的增加,溶质的淌度降低,电渗流减少,迁移时间增加。故实验选择缓冲溶液浓度为0.05mol/L。 2.2.4 SDS的浓度 在其它条件固定的情况下,随着SDS的浓度增加阿德福韦酯的迁移时间也增加。而阿德福韦与阿德福韦单酯不与胶束作用,因此基本不受胶束浓度的影响。故实验选择 0.01 mol/LSDS。 2.2.5 乙腈的影响 阿德福韦酯难溶于水,乙腈的加入能改善其溶解度,因此,本实验向运行缓冲溶液中加入了一定体积的乙腈。在其他条件一定的情况下,发现体体分数为20%的乙腈较为合适,故选择加入20%的乙腈。 2.3 方法学验证 2.3.11线性 配制阿德福韦质量浓度为6.25×10~4.00g.L的系列标准溶液,以峰面积对质量浓度进行线性回归。阿德福韦与阿德福韦酯的质量浓度分量为6.19 ×10~3.96 g.L、6.28×10*2~4.02g.L1,回归方程呈别为A=1.37×10 p-9.09×10,r=0.9998及 A=2.45 ×10'p1.05 x101.,1r=0.999 7。本法阿德福韦或阿德福韦酯线性范围能够满足原料药及制剂的测定要求。 2.3.2 检出限 当S/N=3时,阿德福韦酯与阿德福韦的检出限分别为0.5、0.3mg·Lc。由于 MEKC法的进样量与 HPLC法相差悬殊,其灵敏度与 HPLC法有较大差距[4,10],但在本法测定条件下(供试品质量浓度为500mg·L ),其灵敏度远能满足阿德福韦酯原料药、制剂及有关物质的检测要求。 2.3.3 精密度 取阿德福韦与阿德福韦酯对照溶液,分别连续进样6次,阿德福韦与阿德福韦酯峰面积的 RSD分别为1.9%和2.1%。 2.3.4 稳定性 取阿德福韦与阿德福韦酯对照溶液,分别于0、2、4、8、12h进样,阿德福韦在12h内稳定,峰面积的RSD为1.9%;阿德福韦酯在4h内稳定,峰面积的RSD分别为 1.8%。 2.3.5 回收率 精密称取阿德福韦与阿德福韦酯对照品各约20、25、30mg至 10mL容量瓶中,并按处方量加入空白辅料,按实验方法测定回收率,每份样品进样5次,结果见表1. 表1阿德福韦与阿德福福酯回收率实验结果(n=5) Table 1 Recovery results of adefovir dip ivoxil and PMEA(n=5) Added Found Recovery RSD p/(g.L-) pr/(g.L) R/% s./% PMEA 0.403,0.500,0.599 0.408,0.501,0.598 101,100, 100 1.5,1. 6, 1.9 A defovir dip ivoxil 0.397.0.503.0.602 0.401,0.504,0.593 101.100.98 2. 1,1.7, 2.0 2.4 杂质含量的测定 取3批样品按“1.3"项下制备供试品溶液,每份平行测定3次,记录图谱至主成分峰迁移时间的3倍。采用峰面积归一法测定阿德福韦酯及已知杂质(阿德福韦单酯与阿德福福)的含量,以及未知杂质的总含量,并与 HPLC法进行比较,结果见表 2。 表2阿德福韦酯片剂中杂质含量的测定结果(n=3) Table 2 Deteim ination of impurity in adefovir dip ivoxil tablet(n=3) Method Batch No Adefovir dip ivoxil Mono-POM PMEA PMEA Unknown impurity w/% w/% w/% w/% MEKC 20050412 99. 3 0.5 0.1 0.1 20050415 99.6 0,2 01 0.1 20050422 99.5 0.3 0.1 0.1 HPLC 20050412 99.4 04 0.1 0.1 20050415 99.6 0.2 0.1 0.1 20050422 99.5 0.3 0.1 0.1 实验结果表明:本法检测阿德福韦酯及其杂质的结果与 HPLC法相当。虽然其灵敏度与精密度不及 HPLC法,但是其简单、快速、分析成本低,更适合用于阿德福韦酯的开发、生产及贮藏过程中的质量控制及常规检查。 ( 参考文献: ) ( [1] AUGUSTINS P, A NNAERTP, ADRAENS S, et al H igh s p eed HPLC de t emm ination of bis ( p ivaloyloxymethyl)PMEA and its degradation products, mon o (POM)- PMEA a nd P MEA[J]. 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RP-HPLC法定定阿德福韦酯片中阿德福韦酯含量和有关物质[J].药物分析杂志, 2005,25(5): 5 73-575. ) ( [10 蒋 ] 晔,徐智儒,张晓青.反相高效液相色谱法测定阿德福韦酯及其降解产物[J].色谱,2004,22(3):248-251. ) 第二届中国中西部地区色谱学术交流会暨仪器展览会(第一轮通知) 为了促进中西部地区色谱工作者学术交流与技术合作,第二届中国中西部地区色谱学术交流会暨仪器展览会定于2008年7月在湖北省神农架召开。本届会议由湖北省化学化工学会色谱专业委员会主办。热诚欢迎全国同行参加会议。本届会议拟安排色谱及质谱分析新仪器与新技术专场推介报告,欢欢有关企业报名参加。 征文内容:色谱及相关分离分析技术的基础和应用研究工作均属本次会议征文范围。已在刊物上发表或在全国会议上报告过的论文不在应征之列。应征论文经专家评审后收入本次会议论文集。会议将组织大会报告和分组报告。 征文要求:论文详细摘要不超过A4纸两页,要求上空3 cm,下空2.8 cm,左空 3 cm,右空 2 cm,标题用三号黑体,正文用五号宋体,英文用 Times New Roman字体,单倍行距。文中须注明作者的通信地址、邮编及E-mail地址。 收稿地址:湖北省武汉市武昌喻家山华中科技大学分析测试中心顾小曼收(邮编430074)。请用挂号信邮寄应征论文,同时将电子稿件用 E-mail传至hbsepu@163.com,并注明“中西部色谱会议“字样。 截稿日期:2008年5月31日。 联系人:顾小曼 电话:027-87557451 E-mail: hbsepu@163. com 会议具体日期和注册费用等事宜请见第二轮通知(2008年2月)。 ( 湖北省化学化工学会色谱专业委员会 ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved. http://www.cnki.net
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