蜂蜜中氯霉素检测方案(固相萃取仪)

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全自动固相萃取 (EXTRA)结合液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定蜂蜜中氯霉素的残留量 编号：ANIET151017 摘要：本方法参考《SN/T 1864-2007进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法》标准，建立了利用全自动固相萃取仪 (EXTRA)结合液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测蜂蜜中氯霉素残留量的方法。样品经乙酸乙酯提取， C18柱净化，吹干转换溶剂定容后，用微孔滤膜过滤，用液相色谱-串联质谱检测。。目标化合物的回收率和重现性均较好。本方法简便、灵敏、重现性好、干扰少、特异性好、能满足食品安全法规的需要。 关键词：JH氯氯霉素， EXTRA，HPLC-MS/MS 1引言 氯霉素(Chloramphcnicol， CAP)又称氯胺苯醇或左霉素，主要成分是由委内瑞拉链霉菌产生的代谢物，分子结构式如图1，属于苯醇类广谱抗生素，对需氧菌、厌氧菌、衣原体、支原体、立克次氏体等有效，且价格较低，用作药物常用于家禽疾病治疗和预防。但氯霉素对人体有严重的副作用，其在人体、动物肌体中蓄积时间长，长期使用会导致视神经炎、共济失调等不良反应，能抑制人体骨髓造血功能引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症、灰婴综合症等疾病12I，对人类的健康构成了潜在的危害。欧盟规定在鸡蛋和乳牛中禁止使用氯霉素，在动物源性食品中残留量为 0.3 ug/kg，美国规定在动物性食品中不得检出氯霉素，我国农业部235号公告也将氯霉素列为禁用药物。 图1氯霉素的分子结构式 蜂蜜主要作为营养滋补品、药用和加工蜜饯食品及酿造蜜酒，也可替代食糖作调味品。某些蜂场养蜂时可能使用氯霉素处理蜂房控制蜜蜂疾病，导致蜂蜜中可能残留氯霉素。本文参考《SN/T 1864-2007 进出口 动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法》[3]标准，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合液相色谱-串联质谱联用(High Performance Liquid Chromatography - Triple Quad MassSpectrometry， HPLC-MS/MS)检测氯霉素在蜂蜜中的残留量的方法。在提取完后，选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、淋洗、目标物洗脱和收集等步骤，收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用 HPLC-MS/MS 检测。 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙酸乙酯：液相色谱纯级； 正己烷：液相色谱纯级； 甲醇：液相色谱纯级； 氯化钠：分析纯； 15%氯化钠水溶液：：15g氯化钠溶解于100 mL 水中； 甲醇：水溶液(1：4，V：V)： 100 pg/mL 氯霉素标准储备液：准确称取氯霉素标准品 1 mg，，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100 ug/mL 的氯霉素标准储备液，-20℃以下保存； 100 ug/mL ds 氯霉素标准储备液：准确称取 ds 氯霉素标准品1mg，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100 ug/mL的 d5氯霉素标准储备液，-20℃以下保存； 实验用水均为超纯水(电导率=18MQ.cm)， 取自 Milli-Q 制水机 (Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱： C18，500mg/6 mL， 上海安谱公司； 全自动固相萃取仪： EXTRA，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 液相色谱仪-串联质谱联用仪： Agilent 1290 infinity- 6490 Triple Quad MS， Agilent， USA； 0.22 um PVDF针头式过滤器：天津津腾实验设备有限公司； 分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮吹仪；移液枪； 50mL离心管；梨形瓶；玻璃滴管；收集管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取(5.00±0.01)g样品，置于50ml离心管中，加入一定量 ds 氯霉素标准溶液，加入15 mL15%氯化钠水溶液，振荡使蜂蜜溶解，加入25 mL乙酸乙酯，于旋涡混合仪上混匀 3 min， 以3500 r/min 离心5min， 将上层乙酸乙酯提取液收集于梨形瓶中，样品残渣再加入20 mL 乙酸乙酯，重复萃取操作，合并乙酸乙酯提取溶液，在40℃下水浴减压浓缩至近干。用4 mL超纯水溶解残渣，转移至进样管中备用。 3.1.2净化 C18 固相萃取柱依次用5 mL 甲醇、5 mL 超纯水活化，取备用液过柱，用10 mL水分两次洗涤进样管，洗涤液过 C18固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL 甲醇：水溶液(1：4，V：V)淋洗固相萃取柱，抽干，用5mL甲醇洗脱，收集集脱液。 3.1.3定容 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以甲醇：水溶液(1：4，V：V)定容至1.0 ml， 以 0.22 um滤膜过滤，滤液待进样。 3.2检测方法 3.2.1 EXTRA 净化程序 EXTRA 净化程序如表1所示。 3.2.2色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Kinetex C18 柱 (Phenomenex，L9USA)， 长度100mm， 内径3mm， 涂层粒径2.6um； 柱温30℃，流速：0.25 mL/min， 进样量：10.0uL。 流动相为超纯水(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序如下： 0-1 min 25%B， 1.01-5 min 45%B， 5-7 min45%-25%B， 7-10 min 25% B。 3.2.3质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描，多反应选择监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM)模式；鞘气温度 (Sheath Gas Temperature) 350℃，鞘气流速 (Sheath Gas Flow) 11 L/min， 氮气发生器提供；干燥气温度 (Dry Gas Temperature) 160℃， 干燥气流速 (Gas Flow) 16 L/min， 氮气发生器提供；雾化气压力 (Nebulizer Pressure) 30 psi； 喷嘴电压 (Nozzle Voltage) 1500V； 碰撞气 (Collision Gas) 为高纯氮气，气体纯度≥99.999%。质谱 MRM 采集参数见表2， MRM谱图见 Counts vs. Acquisition Time (min) 图2，工作曲线见图3. 表1利用全自动固相萃取仪(EXTRA)对蜂蜜中氯霉素测定的净化程序 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 6 90 90 活化 5 20 2 水 5 20 上样 样品溶液 5 20 空气 0.5 60 清洗 外针 水 6 90 90 稀释 水 5 20 5 上样 样品溶液 5.5 20 2 空气 0.5 60 清洗 外针 水 6 90 90 稀释 水 5 20 5 上样 样品溶液 5.5 20 2 空气 0.5 60 清洗 外针 水 6 90 90 淋洗 甲醇：水(1：4， V：V) 5 20 2 空气 50 60 20 洗脱 甲醇 6 20 空气 50 60 20 表2目标物及替代物的 HPLC-MS/MS MRM参数、工作曲线线性范围、相关系数和仪器检出限 Compound MS Parameters Linear IDL PT DI CE Range R2 (ug/L) (m/z) (m/z) (eV) (ug/L) d5-Chloramphenicol -328.2 157.0*/126.0 10/20 / / 0.1 Chloramphenicol -321.1 151.0*/257.0 10/5 0.5-10 0.9946 0.1 Counts vs. Acquisition Time (min) 图2目标物的 HPLC-MS/MS MRM 谱图 图3氯霉素外标法工作曲线 4结果与讨论 4.1基底加标回收率及精密度 在(5.00±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到2ng和4ng，考察方法的回收率和重现性。基底加标的 HPLC-MS/MS 谱图如图4，加标回收率、相对标准偏差如如3所示： Counts vs. Acquisition Time (min) 图4基底加标的 HPLC-MS/MS 谱图 表3蜂蜜中氯霉素加标回收率 Spiking Response Concentration Recovery RSD Surrogate RSD Level (ug/L) Recovery 2ng 27139 1.97 98.5% 0.92% 76.5% 1.31% 29352 2.12 100.6% 76.4% 27799 2.01 100.8% 78.1% 4 ng 57812 4.16 100.4% 75.2% 4.2样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，从图4中可以看出，基底干净无干扰峰，分析时间短，只需10min 即可完成一次分析，且基底加标回收率良好，重现性高。 5结论 本方法采用乙酸乙酯对蜂蜜中氯霉素进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用液相色谱仪-串联质谱联用进行检测。检测结果表明，该方法抗干扰性强，具有较高的灵敏度，回收率符合要求，重现性高，本方法可以满足足确、快速的检测要求。 本实验采用了 EXTRA 全自动固相萃取仪进行净化处理，免人工干预，自动完成 SPE 柱活化、样品富集、净化、洗脱和收集等步骤，避免了重复的人工操作及人为误差，能够确保良好的重现性和精确性，适用于大规模样品的快速分析。 ( 参考文献 ) ( [1]张炫，周丹银，郭艳红，等.蜂蜜中氯霉素残留来源与变化研究[].蜜蜂杂质[J]， 2013， (2)：2-10. ) ( [2]陈舒舒，许凯，徐彦军，等.蜂蜜中氯霉素残留的检测及净化方法研究[].安全与环境学报，2006，6(2)： 92-95. ) ( [3] 《SN/T 1864-20 0 7 进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法》 )