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2 3 Thermo Fisher Scientific,San Jose, CA USA is ISO Certified. 17种氨基酸的RSLC分析方法 刘兴国金燕赛默飞(中国)有限公司 关键词:快速液相色谱;紫外检测;氨基酸; 快速方法二: Key words: RSLC; UV detection; Amino acid 引言 氨基酸分析(AAA)常被用作蛋白质组学和食品质量检则中测定样品中氨基酸(AA)准确组成的工具。为了及时分析样品,需要分析周期短;为了测定有限量的样品需要高灵敏度的方法;本文运用Dionex RSLC和2.2pm填料色谱柱对17种氨基酸进行分析,用时短分离度重现性均较好。采用该快速方法整个分析过程最高压力500bar, 在耐压可以达到600bar的普通液相上可以应用,从而可以实现氨基酸在普通液相上的快速分析。 测试条件 仪器: Dionex UltiMate 3000系列:HPG-3400RS泵, DAD-3000RS检测器, WPS-3000TRS自动进样器,TCC-3000RS柱温箱。 时间 (min) 流速(mL/min) 流动相A 流动相B 0 0.7 100 0 1.5 0.7 93 7 5.6 0.3 85 15 6.9 0.3 83 17 7.0 0.8 83 17 8.0 0.8 72 28 9.1 0.8 72 28 9.5 0.8 67 33 12.0 0.8 0 100 12.2 0.8 0 100 12.3 0.7 100 0 14.5 0.7 100 0 柱温:37℃; 样品前处理 检测波长:248nm; 进样量:1pL; 流动相A:称取无水醋酸钠 11.48g溶解于1000 mL纯水中,用磷酸调节PH到约5.2,加1mLEDTA-2Na溶液,再精密加入三乙胺2.37 mL,用磷酸调节PH为4.95,用0.22pm滤膜过滤,备用。 AccQ Tag Fluor Reagent Kit(试剂盒)有5组试剂,每组包括3个试剂瓶,1#瓶为PH=8.8硼酸盐缓冲液,2A瓶为衍生剂(AQC)粉末,2B瓶为乙腈溶液。临用前,吸1.5mL乙腈移入2A瓶中(事前将瓶振荡,使得粉末完全置于瓶底),盖紧盖子,摇10秒,55℃温箱加热使粉末完全溶解(不得超过10min)。 流动相B:乙乙:水(3:2) 氨基酸标样与样品的衍生 快速方法一: 氨基酸标样的衍生 时间 (min) 流速 (mL/min) 流动相A 流动相B 0 0.6 97 3 1.7 0.6 93 7 8.0 0.3 85 15 9.0 0.3 83 17 9.7 0.7 83 17 10.9 0.7 72 28 11.7 0.7 72 28 13.6 0.7 67 33 16.0 0.6 0 100 取氨基酸标样储备液(2.5umoL/mL),临用时用水(1:10)稀释成氨基酸标样工作液250pmoL/pL(每瓶为1mL,直接稀释定容至10mL)。用微量注射器精确吸取10pL工作液,加入微量内衬管小瓶底部,用另一根微量注射器精确吸取pH8.8的硼酸盐缓冲液70pL,加入小瓶中,在旋涡振荡器上混合后,再用一根微量注射器精确吸取AQC溶液20uL, 将小瓶放在旋涡振荡器上边振荡混合边加入AQC溶液,用封口胶带将瓶口封好,放到55℃恒温箱内保温5~10分钟,取出放置至室温,待HPLC系统稳定后上机分析。 样品的衍生 取该氨基酸注射液,精密吸取1mL用去离子水稀释到100mL,从中精密吸取10uL, 其余操作方法同氨基酸标样的衍生。 结果和讨论 标准品色谱图 快速方法一 色谱柱采用Acclaim RSLC 120 C18 2.1×100mm,2.2um (PN: 068982 SN: 001533),分析时间16分钟。洗脱条件见测试条件。 氨基酸标样测定谱图(进样2.5pL)见图1. 图1快速方法一测定氨基酸对照品谱图 采用快速方法去17种氨基酸分析情况见表1. 快速方法二 采用色谱柱Acclaim RSLC 120 C18 2.1×100mm,2.2 um ( PN: 068982 SN:001533),分析时间11分钟。洗脱条件见测试条件。 氨基酸标样测定谱图(进样1.5uL): 图2快速方法二测定氨基酸对照品谱图 采用快速方法二17种氨基酸分析情况见表2. 表1快速方法一分析氨基酸对照品结果 No. Peakname Ret.Time min Area mAU*min Height mAU Resolution | Plates (EP) 1 Asp 6.493 4.0118 43.305 4.87 33104 2 Ser 7.227 5.6903 54.594 1.81 32977 3 Glu 7.517 4.9628 47.589 2.05 34201 4 His 7.857 6.9375 61.862 3.12 33970 5 Gly 8.400 6.6264 57.323 8.26 35569 6 Arg 9.590 4.1055 56.546 1.84 119976 7 NH 9.800 5.8930 76.077 3.36 111216 8 Thr 10.177 3.4260 48.532 4.81 144557 9 Ala 10.693 3.0592 43.775 9.10 156283 10 Pro 11.590 3.3462 57.740 11.13 268290 11 Tyr 12.553 3.1226 58.233 2.86 356301 12 Cys 12.800 4.3207 75.691 5.37 333537 13 Val 13.293 3.9570 63.261 2.24 308494 14 Met 13.510 3.8280 59.687 9.20 304068 15 Lys 14.430 5.9465 87.654 6.17 316904 16 lle 15.060 5.3315 78.197 1.68 347095 17 Leu 15.217 4.0897 75.102 2.67 516546 18 Phe 15.433 4.6523 95.328 n.a. 628154 No.F Peakname Ret.Time min Area mAU*min Height mAU Resolution Plates (EP) 1 Asp 5.050 2.0411 25.294 3.79 23123 2 Ser 5.603 3.2304 32.881 1.52 19616 3 Glu 5.857 3.0091 27.727 1.47 17912 4 His 6.107 3.8109 36.513 2.59 21585 5 Gly 6.533 3.3552 33.722 5.82 25482 6 Arg 7.233 1.3165 27.973 4.25 138991 7 Thr 7.570 1.2970 26.199 3.82 138752 8 Ala 7.877 1.1074 22.934 6.90 155596 9 Pro 8.413 1.2885 27.873 9.02 195094 10 Tyr 9.090 1.3422 29.250 1.83 240070 11 Cys 9.227 1.8003 38.153 3.82 236392 12 Val 9.517 1.4420 31.487 1.66 249619 13 Met 9.647 1.5403 30.913 8.06 225322 14 Lys 10.300 1.7159 35.730 5.09 256876 15 lle 10.693 1.4706 33.029 1.47 337359 16 Leu 10.793 1.4856 34.076 2.18 357308 17 Phe 10.950 1.8588 42.499 n.a. 373594 实际样品的分析 采用快速方法二对某氨基酸注射液进行分析。供试品溶液17种氨基酸测定谱图(进样4uL),见图3. 图3快速方法二测定供试液谱图 供试品溶液连续进样3次,测定结果见表3. 稳定性测定结果(供试品溶液分别在0、1、2、4、6和8h进样分析),见表4. 供试品氨基酸含量测定结果见表5. 结论 RSLC具有宽泛的流速-压力范围、极短的进样周期、超高效的柱温控制、超快速数据采集和处理能力,能够在保持高分离度高灵敏度的超快速条件下实现最好的分析结果。 本实验采用2.2um填料的色谱柱,通过不同的梯度洗脱条件,在U3000 RSLC上开发了两个不同的快速分析方法,分离度均可以达到测定的要求。方法一分析过程最高压力500bar,可以应用到耐压600bar的常规液相上。快速分析方法缩短了分析时间,节省了样品和溶剂使用量,对于目前用户日益增大的样品量和一些不太稳定的样品的分析具有很大的应用空间。 表3快速方法二分析氨基酸供试液精密度结果 1# (mAU*min) 2#(mAU*min) 3#(mAU*min) 平均值 RSD% Asp 3.967 3.966 3.973 3.969 0.09 Ser 3.120 3.007 3.052 3.060 1.85 Glu 1.76 1.669 1.744 1.724 2.80 His盐酸盐 4.189 4.050 4.155 4.132 1.75 Gly 32.012 32.219 32.029 32.086 0.36 Arg盐酸盐 3.148 3.147 3.116 3.137 0.57 Thr 2.828 2.842 2.813 2.827 0.52 Ala 2.841 2.842 2.817 2.833 0.51 Pro 1.129 1.131 1.115 1.125 0.75 Tyr 0.032 0.034 0.032 0.033 2.84 Cys 0.256 0.264 0.254 0.258 2.08 Val 4.497 4.499 4.45 4.482 0.62 Met 2.363 2.357 2.339 2.353 0.54 Lys盐酸盐 5.787 5.765 5.736 5.763 0.44 lle 4.038 4.035 3.994 4.022 0.61 Leu 5.768 5.800 5.764 5.778 0.34 Phe 5.136 5.143 5.111 5.130 0.33 表4快速方法二分析氨基酸供试液稳定性结果 Area (Oh) Area (1h) Area (2h) Area (4h) Area (6h) Area (8h) RSD% Asp 3.3074 3.312 3.2724 3.3688 3.1434 3.1806 2.63 Ser 3.0316 2.9774 2.8083 2.9623 2.8677 2.9263 2.74 Glu 2.9354 3.0374 2.8926 2.8977 3.085 3.0367 2.76 His盐酸盐 4.3904 4.5169 4.4359 4.3983 4.4192 4.5607 1.56 Gly 35.6908 34.6485 35.6347 35.2751 33.2988 33.8236 2.85 Arg盐酸盐 3.2186 3.191 3.1596 3.1086 3.0469 3.0863 2.09 Thr 2.7965 2.8009 2.8033 2.7263 2.6969 2.7409 1.65 Ala 2.4334 2.3679 2.3541 2.4089 2.2592 2.3048 2.75 Pro 1.066 1.079 1.0576 1.0373 1.0403 1.0535 1.49 Tyr 0.0083 0.0086 0.0083 0.0085 0.0082 0.0086 2.05 Cys 0.3076 0.3196 0.3034 0.3071 0.3043 0.2952 2.59 Val 4.3515 4.2569 4.2862 4.2374 4.0345 4.118 2.77 Met 2.4222 2.3936 2.4615 2.4353 2.3102 2.3438 2.41 ys盐酸盐 4.2927 4.2328 4.2563 4.2274 4.0472 4.1176 2.23 lle 3.9065 3.9473 3.9547 3.9473 3.7154 3.7313 2.92 Leu 5.6725 5.5662 5.5643 5.5196 5.2407 5.3511 2.90 Phe 6.1897 6.0956 6.1213 6.1404 5.7862 5.8836 2.68 表5快速方法二分析氨基酸供试液含量结果 对照品进样量 对照品峰 样品进样量 样品峰 含量 各峰之间 (pL) 面积 (uL) 面积 (g/1000mL) 分离度 Asp 1.5 2.0411 4 3.3074 2.020 3.44 Ser 1.5 3.2304 4 3.0316 0.924 1.52 Glu 1.5 3.0091 4 2.9354 1.344 1.53 His盐酸盐 1.5 3.8109 4 4.3904 2.263 2.51 Gly 1.5 3.3552 4 35.6908 7.479 5.81 Arg盐酸盐 1.5 1.3165 4 3.2186 4.825 1.52 Thr 1.5 1.297 4 2.7965 2.405 3.75 Ala 1.5 1.1074 4 2.4334 1.833 6.82 Pro 1.5 1.2885 4 1.066 0.892 9.21 Tyr 1.5 1.3422 4 0.0083 0.010 1.96 Cys 1.5 1.8003 4 0.3076 0.097 3.71 Val 1.5 1.442 4 4.3515 3.310 1.55 Met 1.5 1.5403 4 2.4222 2.197 7.51 _ys盐酸盐 1.5 1.7159 4 4.2927 4.280 5.02 lle 1.5 1.4706 4 3.9065 3.262 1.50 Leu 1.5 1.4856 4 5.6725 4.689 2.20 Phe 1.5 1.8588 4 6.1897 5.151 1.51 thermoscientific.com C 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and itssubsidiaries. Specifications, terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult yourlocal sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线:上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 800 8105118邮编:201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话:021-68654588 邮编:100007传真:021-64457830 电话:010-84193588传真:010-88370548 氨基酸分析(AAA)常被用作蛋白质组学和食品质量检测中测定样品中氨基酸(AA)准确组成的工具。为了及时分析样品,需要分析周期短;为了测定有限量的样品需要高灵敏度的方法;本文运用Dionex RSLC和2.2 μm填料色谱柱对17种氨基酸进行分析,用时短分离度重现性均较好。采用该快速方法整个分析过程最高压力500 bar,在耐压可以达到600 bar的普通液相上可以应用,从而可以实现氨基酸在普通液相上的快速分析。
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