单克隆抗体（mAb）中肽谱分析检测方案(液质联用仪)

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利用甲酸作为离子对试剂进行LC/MS肽谱分析 使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱 应用简报 生物治疗药物与生物制药 作者 前言 Suresh Babu C.V. 安捷伦科技公司 肽谱分析是表征生物治疗蛋白质不可或缺的工具，该方法广泛运用于生物药物蛋白质的生产过程，以确保产品在各生产阶段的完整性和稳定性。利用 LC/MS进行肽谱分析是表征肽段修饰的首选技术。稳定且重现性高的 LC/MS 方法，是成功实现肽谱分析分离的关键。因此，需要对 LC/MS 分离参数进行全面的研究。 分析复杂蛋白质酶解物的过程中，如何实现肽段的高效、高分离度分离是一项巨大的挑战。甲酸是一种兼容质谱的离子对试剂，常用于 LC/MS方法中，可实现灵敏检测。然而，甲酸也会导致峰形展宽，从而使肽段发生共洗脱'。除此之外，流动相含甲酸的现有 LC/MS 方法具有峰容量小、峰展宽以及对相似肽段分离度差的限制。选择正确的反相色谱柱和LC/MS方法，对肽谱分离的成功十分重要。 Agilent AdvanceBio Peptide Plus色谱柱专为高效的肽段分离而设计。HPHPoroshell 填料一覆了一层带正电荷的改性表面基团。采用 C18配基的表面多孔颗粒填料表面带电，可改善峰形并提高峰容量。最佳孔径(120A)和粒径(2.7 pm)能够以低色谱柱反压提供类似 UHPLC 的性能。 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱还可以与含甲酸的流动相兼容，在与质谱联用时可提供出色的峰形。 本应用简报展示了AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱在用含甲酸的流动相对单克隆抗体(mAb) 进行肽谱分离时显示出的卓越性能。本文通过研究流速、梯度时间和温度等不同的填料影响因素，开发出了实现最佳肽段分离的 LC/MS 方法。并对峰容量、峰宽、峰面积、峰高、重现性和序列覆盖率等肽谱分析的关键要素进行了评价。 材料 曲妥单抗购自当地药店并遵照制造商的说明进行储存。DL-二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺 (IAA)、甲酸和 LC/MS级溶剂购自 Sigma-Aldrich。高品质测序级胰蛋白酶(部件号204310)来自安捷伦科技公司。 胰蛋白酶酶解 在用胰蛋白酶酶解 mAb之前，在变性条件下(盐酸胍)将二硫键还原(DTT)并烷基化(IAA)。该预处理可确保 mAb变性并溶解完全，从而使蛋白酶与目标底物发生有效接触。还原和烷基化反应之后，将溶液的 pH值调至7-8，在37℃下进行胰蛋白酶过夜酶解(蛋白质与蛋白酶比例20：1， w/w)。立即用 LC/MS分析样品，或将其储存在-80°℃下待用。 用提取化合物色谱图根据公式1计算峰容量： 漫(Pc)=1+(235)()t=梯度时间W，=平均峰宽公式1. 仪器液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统包括： Agilent 1290 Infinity ll 高速泵(G7120A) Agilent 1290 Infinity ll高容量柱温箱(G7116B) Agilent 1290 Infinity ⅡIMultisampler (G7167B) 质谱系统 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF LC/MS条件 停止时间 34.1分钟 (部件号675950-902) 后运行时间 5分钟 柱温 55°C 流速 0.5 mL/min 流动相A 0.1%甲酸水溶液 流动相B 0.1%甲酸乙腈溶液 参数 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 离子模式 正离子模式，双 AJS ESI (profile) 干燥气温度 325°C 干燥气流速 13L/min 鞘气温度 275°C 鞘气流速 12 L/min 雾化器 35 psi 毛细管电压 4000V 碎裂电压 175V 锥孔电压 65V Oct RF Vpp 750 V 数据分析 Agilent BioConfirm 软件 B.08 结果与讨论 为表征色谱柱性能，所有 LC/MS运行中均采用 mAb 胰蛋白酶酶解物。在给定色谱分离条件下，峰容量是衡量色谱柱性能的重要评估标准。肽谱分析涉及复杂胰蛋白酶解肽段的分离，需要通过优化液相色谱条件提高峰容量。图1A 和图1B描绘了梯度时间和流速对峰容量的影响。将流速从0.1 mL/min 增加到0.5 mL/min，峰容量显著增加，导致峰宽减小。更陡的梯度得到更尖锐的峰形，使峰容 量增加多达30分钟。30分钟的梯度时间后，较长梯度的作用不太明显，仅观察到峰容量的微弱增加。长而平缓的梯度下分离出了更多肽段峰，但分析时间过长。这些结果表明，2.1×150 mm， 2.7 pm 的色谱柱在0.5 mL/min 流速和 60分钟的梯度时间下有最高峰容量。然而，为了在速度和分离度之间取得最佳平衡，将梯度时间固定为30分钟。 为了更好地分离肽段色谱峰，还对柱温的影响进行了研究(图2)。柱温 的变化对肽段分离有重大影响。通常情况下，肽段分离的柱温越高，产生的峰越窄，因此峰容量越高。图2显示了 mAb 酶解物在两种不同柱温下的分析结果。将柱温度从45℃升高至55°℃，峰容量增加20%。肽段分离在55°℃下拥有更好的传质动力学性能，可实现高效的高分离度分离，峰宽更窄。如图2的突出显示区域所示，在更高的柱温下，6-8和25-30分钟的保留时间(RT)窗口内的肽段峰得到了良好分离，灵敏度更高。 图1.流速(A)和梯度长度(B)对峰容量的影响。样品： mAb胰蛋白酶酶解物。在整个色谱图中选择二十个提取化合物色谱峰来计算峰容量。色谱参数： A)梯度时间60分钟， B)流速0.5mL/min。所有其他 LC/MS条件均在“方法”部分中进行了描述 图2.在(A)45℃和(B)55℃ 下用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱进行 mAb 胰蛋白酶酶解物的 LC/MS分离。突出显示的区域表明两个柱温之间的肽段选择性差异。色谱参数：梯度时间60分钟。所有其他 LC/MS条件均在“方法”部分中进行了描述 面的肽谱分析的先决条件。图4A 显示了已鉴定肽段的提取化合物叠加色谱图。重链和轻链的肽谱分析得到99.25%的蛋白质序列覆盖率，质量数准确度为5 ppm。采用 MS/MS分析鉴定氧化、脱酰氨基化和糖基化等各种翻译后修饰(图4B)。 解物的LC/MS色谱图。很明显，AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱提供了尖锐的窄峰，平均峰宽和峰容量分别为0.04分钟中 22pL。在30分钟的梯度时间内，色谱图上的所有峰都得到了良好分离。出色的 LC/MS峰形和肽段峰分离度是实现可靠而全 这一高分离度的肽段分离减少了峰的共洗脱，可准确表征肽段修饰。在较低压力(<350 bar) 下的高分离性能使AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱可用于多种HPLC/UHPLC 仪器。 图3显示了在以甲酸作为离子对试剂的优化条件下， mAb 胰蛋白酶酶 图 3.使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱在优化条件下进行 mAb 胰蛋白酶酶解物的 LC/MS 分析。流速：0.5 mL/min，温度：55℃，梯度时间：30分钟(1.3 min/mL)。使用含0.1%甲酸的流动相获得总离子流色谱图 (TIC) 图 4A. Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱鉴定出的肽段色谱图。匹配肽段的提取化合物叠加色谱图。为清楚起见，部分鉴定出的肽段未标记在图中 General Sequence Match Label m/z 区RT YHeight Tgt Seq Mass Y Sequence Pred Mods VY Diff (Bio，mDa)了 Vol Biomolecule 2482：B(77-87) 656.816 10.6393830 1311.6129 NTAYLQMNSLR 2*Deamidation(+0.984016)B77B84 4.52 29109 Biomolecule 494：B(253-259 4426.2191 4.699 97817 8504219 DTLMISR 1*Oxidation (M)(+15.994915)B256 1.84 369895 Biomolecule 1822：A(1-18) 632.2982 8.316 2074 1893.8738 DIQMTQSPSSLSASVGDR 1*Oxidation (M)(+15.994915)A4 1.73 25701 Biomolecule 214：B(297-305 986.7226 2.409 5146 2957.1443 EEQYNSTYR 1*G2F (NA2F)(+1768.639531)B301 0.24 62854 Biomolecule 192：B(297-305 9932.7057 2.403 23019 2795.0914 EEQYNSTYR 1*G1F(+1606.586706)B301 4.02 401877 Biomolecule 205： B(297-305 878.6872 2.408 20598 2633.0386 EEQYNSTYR 1*GOF (NGA2F)(+1444.533881)B301 348 332787 Biomolecule 1990：B(77-87) 656.3243 9.029 335833 1310.6289 NTAYLQMNSLR 1*Deamidation(+0.984016)B84 2.97 2145587 Biomolecule 2061：B(77-87) 656.3211 9.282 118719 1310.6289 NTAYLQMNSLR 1*Deamidation(+0.984016)B84 -0.89 660229 重现性是肽谱分析的关键属性。图5显示了 mAb 胰蛋白酶酶解物五次进样的叠加色谱图。表1列出了保留时间、峰面积、峰高和半峰宽(FWHM)的精度。 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱表现出绝佳的色谱一致性，%RSD值证明了方法的稳定性。 表1.肽谱分析关键属性的精度。选择整个色谱图中的九个已鉴定肽段峰(图5)用于%RSD计算， n=5 %RSD 峰号 RT 峰面积峰高 FWHM 1 0.11 0.39 0.51 1.24 2 0.02 5.87 2.04 1.71 3 0.07 4.06 1.61 1.39 4 0.06 4.13 1.19 0.78 5 0.06 3.57 1.84 0.85 6 0.04 2.85 0.87 0.66 7 0.04 6.92 3.77 4.33 8 0.02 2.62 1.03 0.53 9 0.01 3.11 1.30 0.95 采集时间 (min) 图 5. LC/MS肽谱分析方法重现性。使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱对 mAb 胰蛋白酶酶解物进行五次重复进样。对用于计算%RSD的九个峰进行了编号 结论 参考文献 ( Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱使用兼容质谱的甲酸改性流动相条件，可获得高峰容量和 尖锐窄峰 ) ( 1. McCalley， D. V. Choice of Buffer for the Analysis of Basic Peptidesin reversed-phase HPLC.Chromatography Online 2005， 8，40-47 ) 质谱兼容的AdvanceBio PeptidePlus 色谱柱可实现高序列覆盖率的出色肽谱分离 ( AdvanceBio Peptide Plus 表面多 孔色谱柱在低背压下运行，从而 使 HPLC 和 UHPLC 系统都可进行肽谱分离 ) 采用 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱的 LC/MS 肽谱分析方法具 有出色的重现性，这一性质对于 肽谱分析至关重要 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年4月20日，中国出版 5991-7979ZHCN Agilent Technologies 前言肽谱分析是表征生物治疗蛋白质不可或缺的工具，该方法广泛运用于生物药物蛋白质的生产过程，以确保产品在各生产阶段的完整性和稳定性。利用 LC/MS 进行肽谱分析是表征肽段修饰的首选技术。稳定且重现性高的 LC/MS 方法，是成功实现肽谱分析分离的关键。因此，需要对 LC/MS 分离参数进行全面的研究。分析复杂蛋白质酶解物的过程中，如何实现肽段的高效、高分离度分离是一项巨大的挑战。甲酸是一种兼容质谱的离子对试剂，常用于 LC/MS 方法中，可实现灵敏检测。然而，甲酸也会导致峰形展宽，从而使肽段发生共洗脱1。除此之外，流动相含甲酸的现有 LC/MS 方法具有峰容量小、峰展宽以及对相似肽段分离度差的限制。选择正确的反相色谱柱和 LC/MS 方法，对肽谱分离的成功十分重要。Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱专为高效的肽段分离而设计。HPH Poroshell 填料包覆了一层带正电荷的改性表面基团。采用 C18 配基的表面多孔颗粒填料表面带电，可改善峰形并提高峰容量。最佳孔径 (120 Å) 和粒径 (2.7 μm)能够以低色谱柱反压提供类似 UHPLC 的性能。AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱还可以与含甲酸的流动相兼容，在与质谱联用时可提供出色的峰形。本应用简报展示了 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱在用含甲酸的流动相对单克隆抗体 (mAb) 进行肽谱分离时显示出的卓越性能。本文通过研究流速、梯度时间和温度等不同的填料影响因素，开发出了实现最佳肽段分离的 LC/MS 方法。并对峰容量、峰宽、峰面积、峰高、重现性和序列覆盖率等肽谱分析的关键要素进行了评价。结论• Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱使用兼容质谱的甲酸改性流动相条件，可获得高峰容量和尖锐窄峰；• 质谱兼容的 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱可实现高序列覆盖率的出色肽谱分离；• AdvanceBio Peptide Plus 表面多孔色谱柱在低背压下运行，从而使 HPLC 和 UHPLC 系统都可进行肽谱分离；• 采用 AdvanceBio Peptide Plus色谱柱的 LC/MS 肽谱分析方法具有出色的重现性，这一性质对于肽谱分析至关重要。