IgG单克隆抗体中氨基酸检测方案(氨基酸分析仪)

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Hitachi High-TechLC Application Sheet在生物药品分析中的应用·氨基酸组成分析~ 生物药品是指运用重组DNA技术及细胞培养技术生产的蛋白质类药品，其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。此次，我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“氨基酸分析法”。氨基酸分析法是测定氨基酸组成和含量的方法，旨在进行蛋白质类药品的结构解析/结构确认。该方法将蛋白质水解为为成蛋白质的各种氨基酸后进行测定。基于水解方法的不同，可能存在无法定量回收的成分，因此，为了全面解析构成蛋白质的氨基酸，需酌情使用多种水解方法。我们以IgG单克隆抗体作为生物药品的模型样品，使用三种方法进行了水解，并进行了氨基酸的分析，在此对结果予以介绍。 ◆氨基酸分析法简介◆ 首先水解蛋白质，使用氨基酸分析仪分析构成蛋白质的各种氨基酸。在蛋白质类药品的试验中，将基于分析所得的氨基酸组成与推测的氨基酸组成进行比较。 *“蛋白质的氨基酸分析法”收录于日本药典第16版的一般试验法中。 ■氨基酸标准样品的测定例 <标准分析法色谱条件> 分析柱 ： #2622PH 4.6 mm I.D. × 60 mm 除氨柱 ： #2650L 4.6 mm I.D. ×40 mm 流动相 ： (PH Buffer Kit) (PH1-4、PH-RG) 流速 ： 0.4 mL/min 柱温 ： 57℃ 反应液 ： 茚三酮 反应液流速 ： 0.35 mL/min 反应温度 ： 135℃ 检测波长 ： VIS 570 nm、(440 nm) 进样量 ： 20 uL 【基于标准分析法的氨基酸标准样品测定例(2 nmol / 20 pL)】 150 目 570 nm o 3 a 3 1 A <特殊分析法色谱条件> 分析柱 ： #2620M 4.6 mm I.D. × 60 mm 除氨柱 ： #2650L 4.6 mm I.D. ×60 mm 流动相 ： 6液(B1、PH2-4、B5、PH-RG) 流速 0.2 mL/min 柱温 ： 38~80℃ 反应液 ： 茚三酮 反应液流速 ： 0.3 mL/min 反应温度 ： 135℃ 检测波长 ： VIS 570 nm、(440 nm) 进样量 ： 20uL (流动相B1、B5使用配套试剂配制) 【基于特殊分析法的氨基酸标准样品测定例(2 nmol /2001pL)】 使用标准分析法测定蛋白质水解后的样品。蛋白质的水解虽有多种方法，但最常规的方法是盐酸水解法。可是使用该方法需设法将难以回收的氨基酸成分转化为不同化合物，有时需结合情况设定最佳分析条件。此次，我们使用标准分析法和针对难以回收成分的特殊分析法进行了分析。 LC Application Sheet Hitachi High-Tech在生物药品分析中的应用 氨基酸组成分析~ IgG水解物的测定例和各种水解方法 500· (1)盐酸水解 440 nm 最常规的水解方法，可对除了色氨酸(Trp)/胱 氨酸(Cys)/蛋氨酸(Met)之外的构成蛋白质的氨 基酸进行定量分析。 因在该水解法中色氨酸几乎全部被破坏，胱氨酸 /蛋氨酸的回收率也偏低，故使用其他水解法。 (2)过甲酸氧化后，盐酸水解 定量分析半胱氨酸/胱氨酸(Cys)及蛋氨酸(Met) 的水解法之一。 使用过甲酸将以上三种氨基酸氧化后，进行水解 。在该方法中，半胱氨酸+胱氨酸以磺基丙氨酸 (CyS0，H)被检测出来，蛋氨酸以蛋氨酸砜 (MetSON)被检测出来。 分析条件使用了特殊氨基酸分析法。 (3)巯基乙磺酸水解定量分析色氨酸(Trp)的水解法之一。通过使用巯基乙磺酸，防止色氨酸氧化。 5 10 15 20 25 30 min l各种水解方法的操作流程 通过互补运用三种水解方法，并使用氨基酸分析仪进行测定，得以全面地分析了IgG单克隆抗体的构成蛋白质的氨基酸。根据结果计算出氨基酸组成，并通过与推测的组成进行比较，可用于蛋白质类药品的试验。此次向您介绍了氨基酸组成分析，但对于蛋白质类药品，还需结合末端氨基酸序列或肽图法的结果等综合地进行解析、评价。 @Hitachi High-Technologies CorporationPage. 仪器配置：日立LA基酸分析仪注意：本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。仪器只是研究用仪器，而不是诊断、治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。Page.@Hitachi High-Technologies Corporation 生物药品是指运用重组DNA技术及细胞培养技术生产的蛋白质类药品，其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。此次，我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“氨基酸分析法”。氨基酸分析法是测定氨基酸组成和含量的方法，旨在进行蛋白质类药品的结构解析／结构确认。该方法将蛋白质水解为构成蛋白质的各种氨基酸后进行测定。基于水解方法的不同，可能存在无法定量回收的成分，因此，为了全面解析构成蛋白质的氨基酸，需酌情使用多种水解方法。我们以IgG单克隆抗体作为生物药品的模型样品，使用三种方法进行了水解，并进行了氨基酸的分析，在此对结果予以介绍。