奶粉和母乳中核苷和核苷酸检测方案(专用色谱柱)

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ThermoFisherSCIENTIFICThe world leader in serving science 方法开发报告 2013-APP-RLC-016UHPLC-MS 同时检测奶粉和母乳中十种核苷和核苷酸 检测项目 十种核糖核苷、单磷酸核苷酸 仪器型号 Thermo Ultimate 3000 系统串丰 TSQ Vantage MS：泵： DGP-3600RS 自动进样器： WPS-3000RS 柱温箱： TCC-3000RS 检测器： DAD-3000RS and TSQ Vantage 色谱软件： Chromeleon 6.8and Xcalibur 方法开发 曾明飞，张婷婷 审核人 金燕 时间 2013.03.20-2013.04.01 1.引言 核苷酸 (Nucleotide)是核苷(Nucleoside) 和磷酸 (Phosphate groups)结合的化学物质，其中核苷一磷酸是有代表性的一系列品种。多个核苷酸连接成锁状的物质由其含有核苷酸的数量分为寡核苷酸(15个或少于15个核苷酸)和多核苷酸(15个核苷酸以上)，后者也是构成 DNA(去氧核糖核酸)和RNA(核糖酒酸)的单位，生物的细胞中都存在。因其具有相当的重要性，对于核苷酸和核苷的研究已经成为目前生物医药，食品添加剂，母婴用品等方面的研究重点。 在一些临床研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉，可以减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。而牛奶中一般不含有核苷酸，且目前的婴幼儿配方奶粉国家标准中未规定这项指标，但是根据核苷酸对婴幼儿的特殊功效，大部分的乳品企业都将其作为重要指标，因此建立简单方便的检测乳制品中核苷酸的方法就显得迫在眉睫。 查阅文献发现，1，目前对于核苷酸和核苷的测定方法主要是基于 HPLC-UV 或 LC-MS为主， 尤其是随着MS技术的普及，采用 LC-MS 方法检测核苷酸和核苷已经逐渐成为主流11-10。然而因为核苷酸与核苷本身的物理化学性质导致其在采用 LC-MS 检测是不可避免会产生局限性。因其强极性性质，，导致其在常规的反相色谱柱上面往往不易保留，对此问题 Coulier 等， Vinas等和Yamaokaa18等采取添加离子对试剂或者 Inoue 等[3]采用 HILIC 的并且选择高浓度的(30 mM甲酸铵)缓冲盐。因此文献中报道的方法普遍存在的检测限过高问题，例如Ren 16等采用 LC-MS 同时检测5种核苷酸检测限都在 0.01 ug/ml以上， Inoue[3]等采用 HILIC-MS 同时检测5中核苷酸检测限为 0.005 ug/ml 以上。 本方法结合已有的 HPLC 方法，通过方法优化，使得能够同时十分灵敏(0.02-1.0 ng/ml)时测定奶粉中十种核苷酸和核苷(包括AMP、IMP、UMP、CMP、GMP、A、I、U、C、G)的方法，并且峰型良好，方法简单方便，与已发表文献相比具有相当的优越性易推广到应用到实际样品的测定中。 2.对照品和样品前处理 2.1标准溶液配制 分别精密称量尿嘧啶定苷(U)、鸟嘌呤核苷(G)、腺嘌呤核苷(A)、肌苷(Ⅰ)、胞嘧啶核苷(C)、单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟嘌呤核苷(GMP)、单磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)、单磷酸尿嘧啶核苷(UMP)、单磷酸胞嘧啶核苷(CMP)固体粉末标准品5.0 mg分别溶解于1ml去离子水中，混匀，分别得到 5.0 mg/ml的十种标准溶液；结构如Fig 1. 取十种标准溶液不同体积，用去离子水稀释混匀得到一系列浓度的标准溶液(0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10、20、100、200、500 ng/ml)。 2.2样品前处理； 奶粉样品：准确确取5.0g左右的样品，用25ml温水溶解后放入超声波水浴中超声震荡 10 min取出，量取20ml 转入50ml容量瓶中，加入1ml 25%的乙酸沉淀蛋白，再用超纯水定容到50ml后混匀，离心取上清液，稀释10倍，过0.222um滤膜，直接进样分析； 母乳：准确量取2ml液体样品，用3ml温水稀释混匀后放入超声波水浴中超声震荡10 min取出，加入0.4 ml 25%的乙酸沉淀蛋白，再加入4.6ml的去离子水到10 ml混匀，离心取上清液，10 倍，过0.22 pm滤膜，直接进样分析； N Fig 1. Chemical structures and fragmentations of nucleotides 3.色谱，质谱分析条件及方法学考察 3.1色谱，质谱分析条件 Tab 1. LC condition for the analysis of nucleotides 流动相 A：5mM ammonium formate in H2O： B：0.1% Formic acid in Methanol； 梯度条件： Time/min Flow Rate (ml/min) A B -2.0 0.4 99 1 0 0.4 99 1 2.5 0.4 99 1 5.9 0.4 90 10 9.0 0.4 62 38 11.9 0.4 62 38 12.0 0.4 99 1 15.0 1 Tab 2. The SRM conditions of nucleotides s in HESI mode in LC-MS/MS Analytes Identity Precursor Product Collision S-Lens Retention time (min) ion (m/z) ion (m/z) energy (eV) CMP M+H+ 324.184 112.082* 15 72 2.40 149.018 17 UMP M+H+ 325.062 97.059* 15 80 2.81 284.284 17 C M+H+ 244.089 95.075 39 63 4.97 112.082* 13 GMP [M+H]+ 364.070 135.057 41 91 6.25 152.053* 19 IMP [M+H]+ 349.070 136.042 21 80 6.63 137.042* 21 U M+H]+ 245.078 112.010 15 63 7.21 113.042* 14 AMP M+H+ 348.078 119.095* 52 103 8.62 136.083 20 M+H+ 269.092 119.071* 36 62 9.38 137.058 14 G [M+H]+ 284.093 135.036* 38 69 9.57 152.058 15 A M+H+ 268.099 119.065* 41 89 10.05 136.087 18 * 为定量离子对 离子源参数： 离子化方式： ESI， Postive Voltage： 5000 V； Capillary Temperature：270.0℃，，VVaporizer Temperature： 380.0℃，Sheath Gas Pressure： 50.0 arb， Ion Sweep Gas Pressure： 0 arb， Auxiliary Gas Pressure：10.0 arb， Collision Gas Pressure)： 1.5 mTorr 质谱扫描参数：分辨率：Q1及Q3均为0.7 FWHM. 3.2方法学考察 3.2.1线性、最低定量限 将上述2.1中配置的系列混标工作溶液：0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10、20、100、200、500 ng/ml 混标工作溶液，进样体积 20ul注入LC-MS，结果显示线性及 LLOQ 结果良好，如 Fig2 和 Tab 3. 100- 100- 100 100- 100 100- C. D. E. F. Fig 2. Representative SRM chromatograms of the nucleotides： LLOQ(A and B)， human milk sample (C and D)，milk powder (E and F) Tab 3. Regression equation， linear range and LLOQ for LC_MS/MS analysis of nucleotides Analyte Regression equation R-squared Calibration Linear range LOQ* Curve (ng/ml) (ng/ml) CMP Y=-197.609+1433.11*X 0.9939 Linear 0.05-500 0.05 UMP Y=-16.7056+488.561*X 0.9945 Linear 0.2-500 0.2 C Y=-150.681+2803.95*X 0.9956 Linear 0.02-500 0.02 GMP Y=-114.235+1104.55*X 0.9899 Linear 0.05-500 0.05 IMP Y=-406.521+693.837*X 0.9923 Linear 0.2-500 U Y=10.6928+145.133*X+0.0147362*X2 0.9979 Quadratic 1.0-500 AMP Y=3.35496+2639.87*X 0.9914 Linear 0.5-500 0.5 Y=-318.38+1876.87*X 0.9984 Linear 1.0-500 1.0 G Y=307.478+1428.61*X 0.9978 Linear 0.2-500 0.2 A Y=2950.58+2958.68*X-0.1978*X2 0.9949 Quadratic 0.5-500 0.5 *Limit of quantitation ((S/N>10). 3.2.2精密度实验 分别取低浓度，中浓度，高浓度的混标溶液，连续进样5次。精密度结果如Tab 4.低浓度的精密度均在9%以内，中、高浓度精密度均在8%以内，结果良好。 Tab 4. Precision of nucleotides (n=5) Nominal Precision (%) Concentration CMP UMP GMP IMP AMP C U I G A Low 5.59 4.79 6.17 6.08 6.28 2.21 3.96 8.27 8.40 3.64 Medium 3.07 6.32 5.70 2.62 7.10 1.28 7.12 4.43 3.25 1.25 High 2.60 1.85 2.06 2.41 3.20 2.45 2.67 2.32 2.53 3.61 3.2.3.加样回收率 分别取奶粉5g， 母乳2ml，分别加入定量的核苷酸混标溶液，按照样品前处理方法制备待测溶液，计算回收率，结果均在80-115%之间，如Tab 5. Tab 5.The recovery of nucleotides (n=5) 样品1(奶粉) 样品2(母乳) 分析物 测量值 加标值 加标后测定 回收率 测量值 加标值 加标后测定 回收率 (ng/ml) (ng/ml) 值(ng/ml) (%) (ng/ml) (ng/ml) 值(ng/ml) (%) CMP 272.0 40 299.0 95.83 307.0 20 339.0 103.7 UMP 198.0 40 209.0 87.82 164.0 20 199.0 108.2 C 36.00 40 68.00 89.47 15.00 20 33.00 94.29 GMP 87.91 40 108.9 85.15 15.04 20 30.95 88.33 IMP ND* 40 34.03 85.08 2.69 20 18.99 83.69 U 120.0 40 142.0 88.75 43.00 20 63.00 100.0 AMP 124.0 40 155.0 94.51 23.00 20 40.62 94.47 I 6.937 40 52.583 112.3 0.688 20 18.29 88.40 G 10.75 40 47.37 93.34 3.620 20 22.20 93.99 A 8.360 40 50.16 103.7 7.642 20 29.56 106.9 *ND： no detected. 4. 样品分析结果与讨论 4.1样品分析结果 选取母乳及婴儿配方奶粉，根据样品处理方法进行测定，每批平行测定2次，结果如Tab 6. Tab 6. Testing result of nucleotides (n=2) 分析物 测定值 奶粉(Hg/g) 母乳(Hg/ml) CMP 27.2 15.4 UMP 19.8 8.20 AMP 12.4 1.15 GMP 8.79 0.75 IMP ND 0.14 C 3.60 0.75 U 12.0 2.15 A 0.84 0.38 G 1.08 0.18 0.69 0.03 4.2讨论 本方法在开发的过程中主要有如下几方面问题：离子化模式选择、化合物灵敏度、峰型拖尾、 离子通道之间的干扰、极性化合物保留、化合物稳定性等。 对于离子化模式的选择，开始核苷酸选择负离子模式，核苷选择正离子模式，但是因为同时检测正负离子，在流动相添加剂方面的不可避免会造成某一模式的损失。后通过查阅文献，同时分析化合物结果，核苷酸中因为氨基和磷酸基团的存在，既可正负离子形式都可以稳定存在的化合物，考虑到同时检测核苷，并且由于正离子模式的灵敏度高于负离子模式，因此优选正离子模式。通过调谐得到的离子对信息与文献报道一致3，断裂方式如Figl。 对于化合物灵敏度优化，因为核苷酸和核苷均为极性化合物， 一般无论是在正离子模式还是负离子模式下，非极性化合物的响应值都明显比极性化合物的响应值高。有研究认为，极性化合物倾向于留在液滴内部与极性溶剂作用，作用过程中失去电荷成为中性分子，而分析物的非极性官能团到达液滴表面，与空气作用降低了与极性溶剂的作用，使其以稳定离子形式存在。基于核苷酸与核苷同时选择的正离子模式，灵敏度较同时正负离子模式要高得多。此外，通过优化离子源参数，包括Capillary Temperature，，Vaporizer Temperature， Sheath Gas Pressure， IonSweep Gas Pressure， Auxiliary Gas Pressure等。文献中选用的方法较多都是高浓度的缓冲液(20mM乙酸铵，或30 mM甲酸铵等)或者离子对时间，甚至使用磷酸盐缓冲溶液13，7，121，这种条件对于仪器或者是方法优化是很不利的。本方法在方法开发的过程中发现乙酸铵的加入对化合物的响应值会有所降低，因此试图不加入乙酸铵等缓冲盐，但是在没有缓冲盐的情况下，核苷酸对峰型很不理想，尤其是UMP呈坍塌状，因此通过优选缓冲盐种类和浓度，最后发现在该条件缓冲液(5mM甲酸铵)，0.1%甲酸，所有化合物峰型理想，响应值没有出现显著下降。因此选择该条件进行方法优化。对于有机试剂，甲醇在离子化效率较乙腈要好，并且还能为碱性化合物提供良好的峰型[13] 考虑到分析物的强极性保留，本实验室所采用的C30色谱谱，保留性较普通C18色谱柱要强，并且能耐纯水相条件，在核苷酸对保留方面发挥了很好的效果，结合优化的流动相，使得核苷酸在色谱柱上的实现了很好的保留，并且较已发表的文献峰型明显良好12，3，6。 ( Reference ) ( 1. Coulier， L .， et al .， Simultaneous quantitative an a lysis of meta b olites using ion-pair liqui d chromatography-electrospray ionization mass sp e ctrometry. Anal Chem， 2006.78(18)： p. 6573 - 82. ) ( 2. Fromentin， E .， et a l.， Simultaneous 一 quantification of intracellular natural a nd antiretroviral nucleosides and n ucleotides by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem， 2010.82(5)： p.1982-9. ) ( 3. Inoue， K .， et al. ， Development and application of an HILIC-MS/MS method for the quantitation ofnucleotides in infant formula. J Agric Food Chem， 2010.58(18)： p.9918-24. ) 4. Jansen， R.S.， et al.， Mass spectrometry in the quantitative analysis of therapeutic intracellularnucleotide analogs. Mass Spectrom Rev， 2011.30(2)：p. 321-43. 5. Neubauer， S.， et al.， Massspectrometry based analysis； of nucleotides， nucleosides， andnucleobases--application to feed supplements. Anal Bioanal Chem， 2012.404(3)： p. 799-808. 6. Ren， Y.， et al.， Simultaneous Determination of 5'-Monophosphate Nucleotides in Infant Formulas byHPLC-MS. Journal of Chromatographic Science， 2011.49(4)：p. 332-337. 7. Vinas， P.， et al.， Ion-pair high-performance liquid chromatography with diode array detectioncoupled to dual electrospray atmospheric pressure chemical ionization time-of-flight massspectrometry for the determination of nucleotides in baby foods. Journal of Chromatography A， 2010.1217(32)： p. 5197-5203. 8. Yamaoka， N.， et al.， Simultaneous determination of nucleosides and nucleotides in dietary foods andbeverages using ion-pairing liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2010.878(23)： p.2054-60. 9. Yang， F.Q.， et al.， Determination of nucleotides， nucleosides and their transformation products inCordyceps by ion-pairing reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr A，2010.1217(34)：p. 5501-10. 10. Cohen， S.， et al.， Liquid chromatographic methods for the determination of endogenous nucleotidesand nucleotide analogs used in cancer therapy： a review. J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci， 2010.878(22)： p. 1912-28. 11. Gustavsson， S.A.， et al.， Studies of signal suppression in liquid chromatography-electrosprayionization mass spectrometry using volatile ion-pairing reagents. J Chromatogr A， 2001.937(1-2)： p.41-7. 12. Gill， B.D. and H.E. Indyk， Determination of nucleotides and nucleosides in milks and pediatricformulas： a review. JAOAC Int，2007.90(5)： p. 1354-64. ( 13. 金亚超，牟.余.，体内药物分析中影响 LC-ESI-MS 离子化的因素.国际药学研究杂志，2011. 38(2)：p.5. ) 核苷酸（Nucleotide）是核苷（Nucleoside）和磷酸（Phosphate groups）结合的化学物质，其中核苷一磷酸是有代表性的一系列品种。多个核苷酸连接成锁状的物质由其含有核苷酸的数量分为寡核苷酸（15个或少于15个核苷酸）和多核苷酸（15个核苷酸以上），后者也是构成DNA（去氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）的单位，生物的细胞中都存在。因其具有相当的重要性，对于核苷酸和核苷的研究已经成为目前生物医药，食品添加剂，母婴用品等方面的研究重点。在一些临床研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉，可以减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。而牛奶中一般不含有核苷酸，且目前的婴幼儿配方奶粉国家标准中未规定这项指标，但是根据核苷酸对婴幼儿的特殊功效，大部分的乳品企业都将其作为重要指标，因此建立简单方便的检测乳制品中核苷酸的方法就显得迫在眉睫。查阅文献发现，目前对于核苷酸和核苷的测定方法主要是基于HPLC-UV或LC-MS为主，尤其是随着ＭＳ技术的普及，采用LC-MS方法检测核苷酸和核苷已经逐渐成为主流[1-10]。然而因为核苷酸与核苷本身的物理化学性质导致其在采用LC-MS检测是不可避免会产生局限性。因其强极性性质，导致其在常规的反相色谱柱上面往往不易保留，对此问题Coulier [1]等，Viñas[7]等和Yamaoka [8]等采取添加离子对试剂或者Inoue等[3]采用HILIC的并且选择高浓度的（30 mM甲酸铵）缓冲盐。因此文献中报道的方法普遍存在的检测限过高问题，例如Ren [6]等采用LC-MS同时检测5种核苷酸检测限都在0.01 μg/ml以上，Inoue[3]等采用HILIC-MS 同时检测5中核苷酸检测限为0.005 μg/ml以上。