滥用药物中低 pH 及高 pH 下分析检测方案(液相色谱仪)

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采用 Agilent Poroshell HPH C18 通过LC/MS 在低 pH 及高 pH下分析滥用药物 应用简报小分子制药 作者 前言 William Long安捷伦科技有限公司 本应用简报使用正离子电喷雾模式 (ESI+)与一般梯度， 对高 pH和低pH条件下的 LC/MS分析几种滥用药物相关化合物进行了对比。人们通常认为分析物分子的离子化状态将取决于流动相的pH， 使用高pH流动相时， LC/MS 在正离子电喷雾模式下的离子化效率将显著降低，因为此时化合物呈中性。然而，许多研究人员对不同类型的样品(包括蛋白质、多肽和氨基酸)进行研究后发现，离子化效率对流动相 pH的增加不敏感，灵敏度甚至还有所提高[1-6]。在ESI+模式下，高pH流动相并不会抑制碱性化合物的离子化；相反会形成大量正离子，而且在高 pH条件下得到的分析物响应通常比低 pH酸性流动相下的响应更高。这一发现非常重要，因为它将普通洗脱方法的适用性扩展至此前难以保留的极性碱性化合物的分析。 然而结果表明，许多可在高 pH 下使用的条件会损坏传统的硅胶 HPLC 色谱柱。使用Agilent Poroshell HPH C18 等可在高 pH 条件下保持稳定的新型色谱柱，无需牺牲色谱柱使用寿命即可通过控制 pH 来调整选择性和灵敏度。色谱工作者可通过这些色谱柱在方法开发中采用表面多孔颗粒技术探索更宽的 pH范围，表面多孔颗粒技术以其高效和快速的特点得到了越来越多的应用[7]。 实验部分 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱与 Agilent 6460三重四极杆质谱仪的联用系统，该系统包括： Agilent 1290 Infinity 二元泵，耐压高达1200 bar (G4220A)，通过在溶剂旁路阀中采用 PEEK 密封垫进行改良 (PEEK FL车子密封垫部件号5068-0171) Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (TCC) (G1316C) Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器 (G4226A)， 配备PEEK转子密封垫 (PEEK FL转子密封垫部件号5068-0170) Agilent Poroshell HPH C18，3×100 mm， 4 pm (部件号695970-502) PEEK FL 密封垫应与碳酸氢铵缓冲液配套使用。Agilent 1290 系列仪器中的标准转子密封垫由 Vespel制成，仅支持有限的 pH范围(1-10)。 PEEK FL 转子密封垫则由特殊的 PEEK 混合材料制成，适用于更宽的 pH范围(1.0-12.5)。将 UHPLC 安装在 A-line 机架上。该系统采用 0.075 pm 管线连接以最大限度减少扩散。这将产生高于传统0.12 mm 或 0.17 mm 内径管线的反压，但这并不会产生问题，因为 4 um Poroshell HPH C18 柱产生的反压极小。表 1列出了 MRM离子对与监测离子。 将甲酸铵和甲酸配制为 5mM的溶液，并用其配制 pH 为3 的低pH 缓冲液。甲酸铵购自 Sigma-Aldrich公司，二次蒸馏甲酸购自GFS。利用碳酸氢铵和氢氧化铵配制 pH 为 10.5的缓冲液，这两种化合物均由 Sigma-Aldrich 提供。 碰撞能量2 化合物 母离子 士的宁 335.2 195 184 41 53 阿普唑仑 309.1 179 281 25 49 MDMA 194.1 97 163 105 25 安非他明 136.1 66 119.1 5 91 17 曲唑酮 372.2 159 176 25 148 37 哌替啶 248.2 128 220.1 21 174.1 17 维拉帕米 455.3 158 165 37 45 美沙酮 310.2 112 265.1 9 29 普罗地芬 354.2 153 167 29 91.1 45 地西泮 285.1 169 193 45 154 25 THC 315.2 150 193.2 20 123.3 30 结果与讨论 在本应用简报中，对以上化合物在碱性流动相和酸性流动相中的洗脱行为进行比较，结果发现碱类在碱性流动相中的保留时间更长。碱性化合物被完全质子化，在反相 HPLC 中的保留特性优于带电化合物。由于这些化合物具有更出色的保留特性，因此可进行更多的溶剂调节以获得更完美的峰间距，如图1所示。梯度和流动相条件如图1中所述。总的来说，某些分析物在碱性溶剂中比在酸性流动相中具有更大的色谱峰。与曲唑酮、维拉帕米、美沙酮和普罗地芬相关的峰在碱性流动相中明显增大。这可能是由于 pH的影响，但也可能是由于化合物保留时间较长以及采用更强的有机流动相进行洗脱。 此前的研究表明， Agilent Poroshell HPH-C18 能够在高 pH 流动相(例如pH为10的碳酸氢铵缓冲液)中长时间使用(进样2000次以上)。因此，色谱工作者如今可在方法开发中采用表面多孔颗粒技术探索更宽的pH范围，而表面多孔颗粒技术也以其高效和快速的特点得到了越来越多的应用。高pH流动相与表面多孔颗粒的配合使用既有益又实用[8]。 ( 1. R. Chirita-Tampu； C. West， L； F ougere； C. Elf a kir.Advantages of HILIC Mobile Phases for LC-ESI-MS-MSAnalysis o f Neurotransmitters. LCGC Europe. 2013， 26， 128-140 ) ( 2. H. P. Nguyen； K. A. Schug. T he advantages of ESI-MSdetection in conjunction with HILIC mode separations： Fundamentals and ap p lications. J. Sep.Sc i . 2 0 08， 31 ， 1465-1480 ) ( 3. S.Zhou；K. D. Cook， J. Am. Soc. Protonation in electrospray mass s pectrometry： Wrong-way-round or right-way-round? Mass Spectrom. 2000， 11，961-966 ) ( 4. B. E. Boyes. Separations and Analysis o f Peptides atHigh pH. 4th WCBP， San Francisco Ca. 2000 ) ( 5. F. E. Kuhlmann； A. Apffel； S. M. Fischer； G. Goldberg；P. Goodley. Signal enhancement for gradient reverse- phase high-performance l iquid chromatography- electrospray ionization mass spectrometry analysis with trifluoroacetic and other strong acid modifiers b ypostcolumn a d dition of propionic acid and isopropanol. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1 995， 6，1221-1225 ) ( 6. C. R. Mallet； Z. Lu； J . R. Mazzeo， Rapid Commun. A s tudyof ion suppression effects in electrospray ionization from mobile phase a d ditives a n d solid-phase ex t racts. Mass S pectrom. 2004， 1 8 ， 4 9-56 ) 7. W. J. Long； A. E. Mack； X. Wang； W. E. Barber. Selectivityand Sensitivity Improvements for lonizable AnalytesUsing High-pH-Stable Superficially Porous Particles.LCGC 2015， 33 (4) ( 8. A. E. Mack J.R. Evans、 W.J. Long.， 使用 Agilent Poroshell 120 色谱柱快速分析现金上的违禁药物残留；应用简报，安捷伦科技公司，出版号5990-6345CHCN， 2010 ) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278， 400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 c 安捷伦科技(中国)有限公司，2015 2015年12月11日，中国出版 5991-6523CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 前言本应用简报使用正离子电喷雾模式(ESI+) 与一般梯度，对高pH 和低pH 条件下的LC/MS 分析几种滥用药物相关化合物进行了对比。人们通常认为分析物分子的离子化状态将取决于流动相的pH，使用高pH 流动相时，LC/MS 在正离子电喷雾模式下的离子化效率将显著降低，因为此时化合物呈中性。然而，许多研究人员对不同类型的样品（包括蛋白质、多肽和氨基酸）进行研究后发现，离子化效率对流动相pH 的增加不敏感，灵敏度甚至还有所提高。在ESI+ 模式下，高pH 流动相并不会抑制碱性化合物的离子化；相反会形成大量正离子，而且在高pH 条件下得到的分析物响应通常比低pH 酸性流动相下的响应更高。这一发现非常重要，因为它将普通洗脱方法的适用性扩展至此前难以保留的极性碱性化合物的分析。然而结果表明，许多可在高pH 下使用的条件会损坏传统的硅胶HPLC 色谱柱。使用 Agilent Poroshell HPH C18 等可在高pH 条件下保持稳定的新型色谱柱，无需牺牲色谱柱使用寿命即可通过控制pH 来调整选择性和灵敏度。色谱工作者可通过这些色谱柱在方法开发中采用表面多孔颗粒技术探索更宽的pH 范围，表面多孔颗粒技术以其高效和快速的特点得到了越来越多的应用。结论此前的研究表明，Agilent Poroshell HPH-C18 能够在高pH 流动相（例如pH 为10 的碳酸氢铵缓冲液）中长时间使用（进样 2000 次以上）。因此，色谱工作者如今可在方法开发中采用表面多孔颗粒技术探索更宽的pH 范围，而表面多孔颗粒技术也以其高效和快速的特点得到了越来越多的应用。高pH 流动相与表面多孔颗粒的配合使用既有益又实用。