纳洛酮中在临床研究中使用Oasis PRiME MCX高效、纯净地萃取多种药物检测方案(固相萃取)

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[应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 在临床研究中使用Oasis PRiME MCX高效、纯净地萃取多种药物 Jonathan Danaceau'、Kim Haynes1和Lisa J. Calton? 1沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 简单的3步或4步SPE方案 相较于反相或传统混合模式阳离子交换技术，残留磷脂量极少 对碱性分析物的回收率非常出色且可重现 沃特世解决方案 Oasis PRiME HLB 96孔uElution板反 OasisPRiME MCX pElution板 Oasis MCX uElution板 ACQUITY""BEH C， 1.7 pm，2.1x100mm色谱柱 XevoTQ-S micro质谱仪 ACQUIT Y UPLCI-Class系统(FTN) MassLynx"软件4.1版 TargetLynx"XS 关键词 固相萃取(SPE)， MCX，混合模式阳离子交换，磷脂去除 简介 由于混合模式固相萃取(SPE)技术可使用LC-MS的兼容溶剂制备纯净的萃取物，因此长期以来被广泛应用于制备生物分析样品中。但是，人们普遍认为该技术比其它技术更复杂，而且相较于其它混合模式技术，强阳离子交换吸附剂在去除相对浓度较高的残留磷脂时，往往效果不佳。2015年推出的全新反相吸附剂Oasis PRiME HLB23已被证明可成功去除生物样品中的磷脂，但它不具备混合模式吸附剂的专属性。为了将混合模式离子子换吸附剂的专属性与Oasis PRiME HLB的高净化度优势相结合，最近Waters基于Oasis MCX混合模式强阳离子交换吸附剂开发了一款新产品-Oasis PRiME MCX。 Oasis PRiME MCX使用3步或4步SPE方案，1可制备出比传统离子交换方案更纯净的萃取物。本文重点介绍了Oasis PRiME MCX的应用，通过分析包括罂粟碱类药物、苯二氮卓类药物、兴奋剂、抗癫痫药物、合成卡西酮以及其其化合物在内的多药物组，证明了该产品用于临床研究的简便性和所得萃取物的高纯净度。此外，还与Oasis MCX和反相吸附剂Oasis PRiME HLB的净化性能做了比较。 实验 试剂级化学品购自Fisher Scientific。目标分析物储备液购自Cerilliant公司(美国德克萨斯州圆石)。人血浆购自LampireBiological laboratories (美国宾夕法尼亚州Pipersville)。 样品制备 用甲醇稀稀高浓度储备液以制备混合储备液，得备分析物浓度分2、10和25 pg/mL的工作储备液。用MilliQ水按1：10的比例稀释工作储备液，得到日常工作溶液。将日常工作溶液加入空白溶液中，得到强化血浆样品。 Oasis PRiME HLB方案：用100pL的5%浓氨水(Fisher， 28%~30%)稀释100pL血浆，然后直接上样至Oasis PRiME HLB pElution板孔内。用200pL水：甲醇(95：5)清洗萃取板。用每次25pL的乙腈：甲醇(比例为90：10、80：20或50：50)对萃取板洗脱2次。进样至LC-MS/MS系统之前，用150uL水：乙腈：甲酸(97：2：1)稀释所有经过萃取的样品。 Oasis MCX方案：用100pL4%的H3PO4稀释100pL血浆，然后直接上样至Oasis MCX uElution板孔内。依次用200 pL2%甲酸和200pL甲醇清洗萃取板。然后，用每次25pL含5%浓氨水(Fisher， 28%~30%)的乙腈：甲醇(50：50)对萃取板洗脱2次。进样至LC-MS/MS系统之前，用150uL水：乙腈：甲酸(97：2：1)稀释所有经过萃取的样品。 Oasis PRiME MCX 4步方案：用100pL4%的H，PO稀释100pL血浆，然后直接上样至Oasis PRiME MCX pElution板孔内。依次用200 pL含2%甲酸的100mM甲酸铵溶液和200pL甲醇清洗萃取板。然后，每次用25pL含5%浓氨水(Fisher， 28%~30%)的乙腈：甲醇(50：50)对萃取板洗脱2次。进样至LC-MS/MS系统之前，用150pL水：乙腈：甲酸(97：2：1)稀释所有经过萃取的样品。 Oasis PRiME MCX 3步案案：用100pL含4% H PO 的200mM甲酸铵稀释100pL血浆，然后直接上样至Oasis PRiME MCX pElution板孔内。然后用200pL甲醇清洗样品，最后每次用25pL含5%浓氨水(Fisher， 28%~30%)的乙的：甲醇(50：50)对萃取板洗脱2次。进样至LC-MS/MS系统之前，用150 pL水：乙腈：甲酸(97：2：1)稀释所有经过萃取的样品。3种混合模式萃取方案如图1所示。 ( 图1.本研究使用的混合模式萃取方案。Oasis MCX4步方案是一套传统的Oasis MCX萃取方案，无需活化和平衡。Oasis PRiME MCX 4步方案在Oasis MCX方案的第一个清洗步骤中加入了100 mM甲酸铵。 O a sis PRiME MCX3步方案 在样品稀释剂中加入了200mM甲酸铵， ， 省去了水溶液清洗步骤(清洗1)。 ) 方法条件 MS系统：Xevo TQ-S microLC条件电离模式：ESI+LC系统： ACQUITY UPLC I-Class (FTN)脱溶剂气温度：500℃色谱柱：ACQUITY BEHC，脱溶剂气流速：1000L/h1.7 um， 2.1x100 mm锥孔气体流速：150 L/h柱温： 40°℃采集范围：针对各化合物优化的MRM通道样品温度： 10℃毛细管电压：1.0 kV进样体积： 2pL碰撞能量：针对各化合物优化的碰撞能量流速：0.6 mL/min锥孔电压：针对各化合物优化的锥孔电压流动相A： 0.1%甲酸的MilliQ水溶液流动相B： 0.1%甲酸的乙腈(ACN)溶液数据管理灌注溶剂： 50：50甲醇：水MS软件：MassLynx 4.1版清洗溶剂： 25：25：25：25 甲醇：水：异丙醇：乙腈定量软件：TargetLynx XSLC梯度程序如表1所示。 表1.UPLC梯度程序。 时间 流速 % % (min) (mL/min) 流动相A 流动相B 0.0 0.6 98 2 3.33 0.6 33 67 4.0 0.6 10 90 5.5 0.6 10 90 6.0 0.6 98 2 7.0 0.6 98 2 通过对共有碎片离子m/z 184执行母离子扫描定量分析磷脂含量。 结果与讨论 本研究使用反相SPE(Oasis PRiME HLB)和混合模式SPE(Oasis MCX和Oasis PRiME MCX)萃取多种化合物，研究了多个性能参数，包括萃取回收率、基基效应以及萃取物纯净度(根据残留磷脂衡量)。表2列出了所有目标分析物、其保留时间以及预测的LogP值。图2所示为所有目标化合物的色谱图，图中选择性地标示出了一部部化合物。 表2.目标分析物、LogP值和保留时间。LogP值来源于Chemicalize。 图2.本研究分析的所有化合物的色谱图，图中选择性地标示出了一部分化合物。 图3A展示了Oasis PRiME HLB萃取所有分析物的回收率。使用推荐的初始洗脱液(90：10乙腈：甲醇)时，大多数分析物的回收率都较低，该洗脱液是为了最大限度减少磷脂残留而设计的。尽管增加洗脱溶剂中甲醇的比例可大幅提升大多数化合物的回收率，但某些化合物的回收率仍然低于20%，例如普瑞巴林和加巴喷丁、罂粟碱类药物(例如甲氢可酮、去甲芬太尼和去甲哌替啶)以及兴奋剂(例如甲基苯丙胺和MDMA)。其它许多化合物的回收率也在50%以下。这是反相SPE对极性、可电离分子萃取效果不佳的一个典型示例。三种条件下的基质效应如图3B所示。 图3A.Oasis PRiME HLB的萃取回收率。萃取方案详见“材料与方法”一节。用90：10、80：20和50：50的乙腈：甲醇洗脱样品所得的回收率分别用红色、蓝色和绿色表示。图3B.使用Oasis PRiMEHLB萃取样品后的基质效应。颜色编码与图3A相同(每种洗脱液N=4)。 为了专门萃取碱性化合物，同时达到与Oasis PRiME HLB相当甚至更高的纯净度，沃特世开发出了Oasis PRiME MCX， 这是一款基于Oasis MCX 技术的反相混合模式萃取产品。 Oasis PRiME MCX及其萃取方案专为萃取碱性化合物而设计，还拥有去除残留磷脂的优势。沃特世开发了3步和4步两套全新的萃取方案，旨在最大限度提升碱性化合物的回收率，同时将残留磷脂量降至最低。 图4展示了Oasis MCX以及Oasis PRiME MCX 3步和4步方案对各种目标化合物的回收率。显而易见，3步方案、4步方案或传统Oasis MCX方案的萃取效率几乎没有差异。图4B展示了混合模式萃取的基质效应。除维拉帕米外，大多数分析物的基质效应都低于20%。 图4A. Oasis MCX和Oasis PRiME MCX萃取方案的萃取回收率。萃取方案详见“材料与方法”一节和图1。 图4B.Oasis MCX和Oasis PRiME MCX萃取方案的基质效应。颜色编码与图4A相同(每个方案N=4)。 图5和图6比较了使用图1所示的方案萃取样品之后，所得样品中的磷脂含量。图5A为3步和4步Oasis PRiME MCX方案以及传统Oasis MCX方案所得样品中残留磷脂的色谱图。总峰面积如图5B所示。峰面积归一化结果显示，与传统Oasis MCX萃取方案相比，3步和4步的Oasis PRiME MCX方案分别去除了95%和98%的磷脂。此外，我们还将磷脂去除率结果与专为去除生物样品中磷脂而设计的Oasis PRiME HLB方案进行了比较。如图6所示，3步Oasis PRiME MCX 萃取方案的磷脂去除率与Oasis PRiME HLB萃取方案不相上下，而4步Oasis PRiME MCX萃取方案的磷脂水平便远远低于采用推荐洗脱液(乙荐：甲醇90：10)的Oasis PRiMEHLB方案。不出所料，如果为了提高Oasis PRiME HLB萃取的回收率而提高甲醇比例，会导致残留磷脂量显著增加。 图5A.Oasis MCX和Oasis PRiME MCX萃取方案的残留磷脂色谱图。三张色谱图以相同的刻度显示。 图5B.图5A中残留磷脂峰的相对峰面积。柱形图旁的标签中显示了磷脂峰面积的相对丰度(N=4)。 图6A.Oasis MCX萃取方案、Oasis PRiME MCX萃取方案和Oasis PRiME HLB萃取方案的相对磷脂峰面积。图6A为各个方案的平均磷脂峰面积。图6B是图6A的放大图，突出显示了Oasis PRiME MCX和Oasis PRiMEHLB方案的低丰度峰面积。Oasis PRiME HLB下面的数字表示萃取吏使用的乙腈和甲醇比例。 结论 Oasis PRiME MCX系列不断开发出的SPE 工作流程和产品不仅更加简单、快捷，而且可得到更纯净的萃取物。尽管Oasis PRiME HLB可以有效地将残留磷脂量降至最低，但在萃取极性、可电离的碱性化合物(如本研究所分析的化合物，见图3A)时，这种方案并非最佳选择。相比之下，传统混合模式离子交换吸附剂/萃取方案萃取这类化合物的回收率较高且可重现(图4A)，但会残留大量磷脂。在临床研究中，使用Oasis PRiME MCX方案能够有效且可重现地萃取生物样品中的碱性化合物，萃取效果与Oasis MCX方案相当。与此同时，相较于传统的Oasis MCX方案，该方案可去除98%的残留磷脂，残留率甚至可比Oasis PRiME HLB方案更低。因此， Oasis PRiME MCX兼具磷脂去除能力以及混合模式聚合物SPE吸附剂的高专属性、高选择性优势。 仅供研究使用。不适用于诊断。 ( 参考文献 ) ( 1. Chambers，E. ， Wagrowski-Diehl， D. M.， et al.Systematic and c omprehensive strategy forreducing matrix effects in LC-MS/MS a n alyses. Journal of Chromatography B 2007.852(1-2)2 2 -34. ) ( 2.[ Danaceau，J.P. and Chambers， E. Analysis of plasma 17-hydroxyprogesterone，androstenedione and cortisol using a novel solid-phase extraction (SPE)sorgent，Oasis PRiME HLB，for UPLC-MS/MSanalysis in clinical research. 2015 May； Waters Application Note 1-5 ( 7 200054 16 EN ) . ) ( 4.( Chemaxon.2017， from ht tps ： // ch e m icalize. c om. ) 在临床研究中使用Oasis PRiME MCX高效、纯净地萃取多种药物 本文重点介绍了Oasis PRiME MCX的应用，通过分析包括罂粟碱类药物、苯二氮卓类药物、兴奋剂、抗癫痫药物、合成卡西酮以及其它化合物在内的多药物组，证明了该产品用于临床研究的简便性和所得萃取物的高纯净度。此外，还与Oasis MCX和反相吸附剂Oasis PRiME HLB的净化性能做了比较。