生物组织中生物元素成像检测方案(激光剥蚀进样)

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分析化学FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第44卷2016年11月第11期1646~1651 张欣颖等：基于激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析第11期1647 DOI： 10.11895/j.issn.0253-3820.160109 基于激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析 张欣颖，郑令娜 王海龙 史俊稳 丰伟悦2李亮*1三王萌*2 武汉工程大学材料科学与工程学院，武汉430205) 中国科学院高能物理研究所纳米生物效应与安全性重点实验室，北京100049) 摘 要 生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，也与许多疾病密切相关。现代生物医学的研究亟需能在组织、细胞等不同水平上原位分析生物样品中微量元素的分析方法。本研究建立了激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱 LA-ICP-MS)原位分析生物样品的方法。采用线扫描模式和较小的激光输出能量 k1J/cm²)，得到了鼠脑切片和金纳米颗粒暴露后单细胞的金属元素成像图。 LA-ICP-MS 具有空间分辨率高、检出限好、运行成本较低等优势，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。 关键词 电感耦合等离子体质谱；激光剥蚀；元素成像；单细胞分析；鼠脑切片；金纳米颗粒 引 言 生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，参与多种生物化学过程“，如金属离子常作为蛋白质的活性中心，催化和调节生物体内的化学反应。微量元素还与一些疾病的发生发展密切相关。研究发现，阿尔茨海默病 Alzheimer’s disease， AD)患者大脑的沉积斑中有高浓度的铜、锌、铁离子“；金属离子在脑组织微区区的代谢紊乱、氧化应激与 AD 的形成和损伤关系密切小。因此，生物样品中微量元素的分析和检测，特别是元素的原位微区分析，无论对于研究微量元素在生物体内的结构、功能和生物效应，还是对于阐明与微量元素相关疾病的发病机理，寻找这些疾病的预防和治疗策略，都具有重要的意义。 生物体内微量元素的分析主要使用原子吸收、原子子射、原子荧光、无机质谱等原子光谱/质谱仪器完成。常规方法大都需要使用强酸消化样品，前处理过程冗长而繁琐，一般只能得到元素总量的信息，而无法得到元素在生物样品中的分布信息。如果采用具有空间分辨能能的原位分析方法，如二次离子质谱、激光电离飞行时间质谱、同步辐射X射线荧光线、激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱 Caserablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry， LA-ICP-MS)等方法，可以实现生物样品中元素的原位、微区分析，得到元素成像图。 在上述原位元素分析方法中， LA-ICP-MS 由于具有空间分辨率好约5um)、分析检出限低(0^g/L级)仪器商品化程度高、运行成本较低等优点，逐渐成为应用最广泛的元素成像方法110，11。杨红霞等利用 LA-ICP-MS 原位分析了印度芥菜中的7种元素，得到了植物茎中的元素分布图；冯流星等将同位素稀释法应用于 LA-ICP-MS 的定量分析，建立了生物切片中 Fe 元素的原位定量分析方法。本实验详细描述 LA-ICP-MS元素成像的步骤和方法，并将建立的方法应用于鼠脑切片和单个细胞的元素成像分析。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 NWR 213 Nd：YAG 激光剥蚀系统美国New Wave 公司)；四极杆电感耦合等离子体质谱仪 Nex-ION 300D ICP-MS，美国 Perkin Elmer公司)；冷冻切片机德国LEICA 1900) ； Nunc Lab-Tek II 腔室载玻片美国赛默飞世尔科技有限公司) ( 2016-02-9收稿；2016-04-11接受 ) ( 本文系国家自然基金科学项目 Nos. 21175136，U1432241，11505194)资助 ) ( * E-mail： m sell08@1 6 3. com； wangmeng@ ihep.ac. cn ) 本实验所用小鼠 C57BL/6J)购自中国医学科学院实验动物研究所；高纯Ar 气和 He气购自北京普莱克斯公司；LA-ICP-MS调谐用标准物质 6RM 612)，30 nm金纳米颗粒 RM 8012)购自美国国家标准与技术研究院 NIST)；细胞培养基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、链霉素均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。 2.2 样品前处理 3 月龄正常小鼠麻醉后，用生理盐水快速灌注 15 min，再断头取脑组织。将脑组织快速冷冻，制成30um 厚的冠状切片，置于干燥器中备用。 小鼠巨噬细胞 RAW 264.7)用含有10%小牛血清 FBS)、100 ug/mL 链霉素、100 units/mL 青霉素的DMEM/F12培养基在培养箱中37℃，5% CO，)培养。 NIST金纳米颗粒超声处理后，用纯水稀释至合适的浓度，加入细胞培养液。细胞暴露于0.1 mmol/L 金纳米颗粒4h后，吸出细胞培养液，用PBS反复清洗后，将细胞转移至腔室载玻片，待细胞贴壁后，除去腔室间的隔断，将载玻片置于干燥器中备用。 2.3 LA-ICP-MS实验 表1 LA-ICP-MS仪器参数 激光剥蚀产生的气溶胶由 He 气载带出样品池，通过三通与Ar 气混合后进入 ICP-MS分析。ICP-MS 用 NIST 612 调谐，使U、Th信号最强且得到较低的氧化物产率(UO*/U*)。 LA-ICP-MS所用的仪器参数见表1。 Table 1 Working parameters of laser ablation-inductivelycoupled plasma-mass spectrometerLA-ICP-MS) LA采用线剥蚀模式，激光剥蚀时自动触发ICP-MS 以时间分辨模式采集质谱数据。所得数据用 Microsoft Excel 处理，用 Igor Pro.美国Wave Metrics 公司)软件画出元素成像图。 3 结果与讨论 激光烧蚀系统可以作为ICP-MS 的固体进样装置，工作时激光束先剥蚀样品表面，产生的固体气溶胶被载气运送至等离子体而完成电离，然后在质谱中得到检测。LA-ICP-MS的准确分析需要尽可能地满足下面3个条件：：()激光剥蚀产生的气溶胶与固体样品的组成相同；2)气溶胶可以高效率地传输至质谱；i3)进入质谱的气溶胶可以完全电离14。在实际分析过程中，上述条件常常很难完全满足，这样会导致“元素分 雾化气 Nebulizer gas 鼠脑切片 细胞样品 辅助气 Auxiliary gas Brain sections Cell samples 检测核素 Isotope monitored 13 c，57Fe，63 Cu，Zn 2Mg，1Au 停留时间 Dwell time 250 msper isotope 500 msper isotope 光斑尺寸 Spot size 40 um 8 um 剥蚀线间距 Ablation line spacing 40 pm 8 um 激光输出能量 Laser energy 40% 80% 线扫描速率 Scan speed 40 um/s 8 pm/s 能量密度 Fluence 0.25 J/cm 0.45 J/cm 馏”不同元素在LA-ICP-MS分析过程中的行为差异)的产生。为了校正激光能量、样品厚度、漂移对质谱响应的影响，LA-ICP-MS元素成像分析时，需要选用适合内标元素。还要使用基体匹配的标准，以获取准确的定量分析结果。研究表明，相比过去常用波长的激光器如266 nm)，使用213 nm 波长的Nd：YAG激光剥蚀得到的样品更为均匀，元素分馏效应更小5。使用氦气作为载气，可以有效地提高气溶胶的传输效率，从而提高分析的灵敏度6。因此，在本实验中，使用波长为213 nm 的激光，采用He 气作为载气，并采用C的信号作为内标校正元素。 3.1 剥蚀模式的选择 元素成像可采用点剥蚀模式 6pot ablation)或线剥蚀模式 Cine ablation)完成图1)。在点剥蚀模式中，激光在样品表面每隔一定距离取一点剥蚀样品，重复操作直到激光采样的点阵覆盖整个样品。在此模式下，采集的数据真实反映每个采样点上的元素信息，激光光斑越小，采样点越多，得到的元素成像图的分辨率越高。而在线剥蚀模式中，在样品表面每隔一定距离设置一条剥蚀线段，重复设置剥蚀线段，直到激光采样的线段覆盖整个样品。工作时激光沿直线连续剥蚀样品，此时，元素成像图的分辨率 图1 剥蚀模式示意图。 ：点剥蚀模式；b：线剥蚀模式) Fig.1 Schematic of two ablation modes：spot ablation；b： line ablation) LA-ICP-MS分析时，如果采用点剥蚀模式，在两个剥蚀点之间需要耗费较多的时间等待质谱信号回到本底水平，才能进行下一点的分析。这样减少了有效质谱分析时间的比例，增加了元素成像分析所需要的时间。所以在本实验中，采用线剥蚀模式，并使用两种剥蚀参数分别应用于鼠脑切片和细胞样品见表1)。需要注意的是，由于剥蚀参数的选择，最终得到的元素成像图在激光扫描的方向常会拉长变形，一般需要在最后处理过程中恢复原始比例。 3.2 激光能量的选择 与地质样品不同，生物样品的含水量较高，因此在剥蚀时，必须有效地控制剥蚀条件，既要实现完全剥蚀样品，又要避免用过高的能量剥蚀而使样品中的水大量汽化，造成样品不规则撕裂和严重的元素分馏。此外，在分析生物样品时，选择较低能量密度 k1 J/cm²)，有利于得到稳定的激光脉冲。有文献报道，使用低温样品池可以有效减少由于样品中水分汽化而造成的负面影响。但是由于低温样品池结构复杂，价格昂贵，从而限制了其实际应用。我们发现，通过选择合适的激光能量，也可以实现对生物样品的有效剥蚀，而不必采用低温样品池。图2显示了不同能量的激光剥蚀鼠脑切片的结果，可以清楚地看出，对于本实验中的鼠脑切片样品来说，选用40%的激光输出能量，即可得到较好的剥蚀效果。如果输出能量大于40%，会导致激光穿透样品而剥蚀载玻片，从而引入了来自载玻片的元素干扰，还会造成切片样品的不规则剥蚀。对于实验中的细胞样品，经过对比，选用80%的输出能量可以达到良好的剥蚀效果。 3.3 鼠脑和细胞的元素成像图 元素C 作为生物样品的内标校正元素，Fe，Cu，Zn 是生物体中重要的必需微量元素，具有多种生物功能。所以，本研究选择分析以上元素。 LA-ICP-MS分析得到的鼠脑元素成像见图3.从图3可以清楚地分辨小鼠脑的不同区域，并可以看出 Fe， Cu， Zn 等重要微量元素在各个脑中中的分布情况。由于Fe 元素在 ICP-MS 中受到 ArO*等多原子离子的严重干扰，所以得到的Fe 元素成像图不如其它元素成像图清晰。文献[18]报道，采用碰撞反应池技术可以消除测量时的质谱干扰，得到更加清晰的Fe 元素成像图。由于缺乏可用于 LA-ICP-MS定量分析物生物标准参考物，定量元素成像分析相对困难。国外实验室常自制基体匹配的生物切片标准物质，采用外标校正的办法，实现生物样品的定量元素成像 如果 LA-ICP-MS技术与免疫组织化学方法合结合，使用元素标记的抗体与切片上的待测抗原反应，通过分析标记的元素，可以得到切片上蛋白质抗原)的分布信息，进一步拓展 LA-ICP-MS 在生物成像分析的应用范围。 Seuma 等成功得到了两种癌症生物标志物在组织上的成像。利用类似的方法，Wang等20同时得到了 Fe，Cu，Zn 等金属元素和β-淀粉样蛋白在老年痴呆模型鼠脑切片中的元素和分子成像图。 图4是暴露金纳米颗粒后的单细胞光学成像和元素成像图。在本实验条件下，除了 Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。这主要是由于细胞中的这些元素含量较低，或者是由于分析这些元素时存在较为严重干扰。从图4可见，Mg和Au元素浓度较高的位置与光学显微镜中细胞所在位 图2 不同激光输出能量t()剥蚀鼠脑切片效果图 Fig. 2 Ablation of mouse brain sections with different laser output energy%) 置重合，而在没有细胞的位置，Mg 和Au元素浓度很低。因此可以确定，Mg 和 Au 的元素信号分别来自于细胞本身和进入细胞的金纳米颗粒。 为了准确得到单个细胞中的元素含量，需要发展合适的定量标准和校正方法。Wang 等使用微喷系统制备了与细胞大小和含碳量相似休标准液滴，作为基体匹配的单细胞定量标准，成功实现 LA-ICP-MS定量分析单细胞中的金属纳米颗粒。此外，现有的激光器最小光斑约为5 um，如果希望用 LA-ICP-MS 技术得到单个细胞中的元素成像图，则需要进一步提高空间分辨率。Becker 等提出的近场剥蚀技术，将 LA-ICP-MS 空间分辨率提高到亚微米级，有望真正实现单个细胞成像分析22。 图3 小鼠脑冠状切片的元素成像图 Fig.3 Elemental imaging of a coronal section from mouse brain 4 结论 本研究建立了 LA-ICP-MS元素成像方法，得到了鼠脑切片、单细胞等不同水平生物样品的元素成像图。 LA-ICP-MS由于具有空间分辨率高、检出限运、运行成本较低等优势，有望作为其它生物成像技术的有力补充，在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。 图4 单细胞光学成像和元素成像图 Fig.4 Optical imaginga) and elemental imaging6， c) of single cells References ( Li Y F， Chen C Y， Qu Y， Gao Y X， Li B， Zhao Y L， Chai Z F . 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Spectrom.， 2 006， 21()：19-25 ) Elemental Bio-imaging of Biological Samples by LaserAblation-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry ZHANG Xin Ying， ZHENG Ling Na’， WANG Hai Long’， SHI Jun Wen’， FENG Wei Yue’， LI Liang， WANG Meng* School of Material Science and Engineering， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430205， China) ‘Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety， Institute of High Energy Physics， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China) Abstract Trace elements play a very important role in biological organism and closely related to manydiseases. The new analytical methods are urgently needed for in-situ determination of trace elements inbiological tissues or single cells.Amethod based on laser ablation-inductively coupled plasma-massspectrometry LA-ICP-MS) was developed for such in-situ analysis. Line ablation mode was chosen and theoutput energy of the laser was also optimized at a low fluence of less than 1 J/cm’. The two kinds of elementalbio imaging of both a coronal section from mouse brain and single cells exposed to gold nanoparticles wereobtained by the developed method. Because of the unique characteristics， such as good spatial resolution，excellent detection limit， and reasonable running cost， LA-ICP-MS will be applied widely and become a usefultool in biomedical research in the future. Keywords Inductively coupled plasma-mass spectrometry； Laser ablation； Elemental bio-imaging； Singlecell analysis； Mouse brain sections； Gold nanoparticles Received 19 February 2016； accepted 11 April 2016) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China Nos. 21775136， U1432241，11505194). 2017年《色谱》征订启事 国内统一连续出版物号CN 21-1185/06邮发代号8-43国际标准连续出版物号 ISSN 1000-8713国外发行代号 DK21010CODEN 编码 SEPUER 《色谱》是色谱专业期刊，主要报道色谱学科的基础性研究成果，色谱及其交叉学科的重要应用科研成果及最新研究进展。适于科研院所及分析测试领域等从事色谱基础和应用技术研究的科研人员、色谱及其相关学科的硕士及博士研究生、色谱器件及仪器的开发人员阅读。 《色谱》已被美国《医学索引》 Medline)、美国《化学文摘》 CA)、荷兰 Elsevier Scopus、美国《剑桥科学文摘》CSA)、俄罗斯《文摘杂志》AJ)、波兰《哥白尼索引》(C、《日本科学技术文献数据库》(ICST)和英国皇家化学学会系列数据库中的《分析化学文摘》AA)、《工业化学灾害》 CHI)、《质谱学通报报补)》MSB-S)等收录。连续多年入选 CA 千刊表 《色谱》在国内也具有较高的影响力。曾连续入选百种中国杰出学术期刊，是中国科学院优秀期刊、中国科协优秀期刊、中国科技核心期刊、中国精品科技期刊、中文核心期刊、中国科协精品科技期刊工程项目及中国中科院科学出版基金择优支持期刊。 《色谱》近几年在中国科学技术信息研究所的影响因子等评价指标一直名列化学学科期刊前茅。2016年公布的影响因子为1.763，列全国化学类核心期刊第二名。 《色谱》每月8日出版。单价20元，全年240元。请在全国各地邮局订阅，邮发代号8-43；也可直接与《色谱》编辑部联系订购，联系人：魏桂林。 网址： www. chrom-China.com；地址：大连市中山路457 号；电话： 0411)84379021； E-mail： sepu@ dicp. ac. cno ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，也与许多疾病密切相关。现代生物医学的研究亟需能在组织、细胞等不同水平上原位分析生物样品中微量元素的分析方法。本研究建立了激光剥蚀－电感耦合等离子体质谱（ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ）原位分析生物样品的方法。采用线扫描模式和较小的激光输出能量（＜1 Ｊ／ ｃｍ2），得到了鼠脑切片和金纳米颗粒暴露后单细胞的金属元素成像图。ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ 具有空间分辨率高、检出限好、运行成本较低等优势，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。