肉制品中四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物多残留量检测方案(固相萃取仪)

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自动化样品前处理解决方案-RK-2020 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 全自动固相萃取；；全自动氮吹浓缩仪；液相色谱一串联质谱； 四环素类；磺胺类；喹诺酮类 四环素类药物(TCS)、磺胺类药物 (SAS)和喹诺酮类药物(((QNS)是畜牧养殖中常用到的三类药物。它们具有抗菌、抗支原体、抗球虫等作用， 常用来治疗或预防鸡的细菌、支原体和球虫感染。动物饲养过程中不科学地使用这些药物会导致其在动物源性食品中的残留超标，影响人类健康，，并且会使细菌的耐药性增强，从而影响这几类药物在人类疾病治疗上的作用。因此，许多国家对动物性食品中这几类药物的最高残留限量(MRL)都做了规定。 2022年2月1日， GB31658.17-2021《食品安全国家标准动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类多残留量的测定液相色谱-串联质谱法》正式实施，为动物性食品中这3大类药物的多残留测定提供了检测依据。 本文参考上述标准，试样中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药类，用MCLLVAINE-NA2EDTA缓冲液提取，使用HLB柱经睿科RAYKOL FOTECTOR PLUS全自动固相萃取仪净化，洗脱液经睿经RAYKOL EVA 80全自动氮吹仪浓缩，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 1.仪器和耗材 仪器 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 Agilent 1290II/6470 高效液相色谱-串联质谱仪 Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪 耗材 HLB 固相萃取柱 (RayCure， 200 mg/6 mL) 试剂 甲醇(优级纯) 乙腈(优级纯) 正己烷(优级纯) 超纯水 0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液：取磷酸二氢钠7.8g， 用水溶解并稀释至1000 mL. 0.05 mol/L 磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠17.9 g， 用水溶解并稀释至1000 mL. 磷酸盐缓冲液：取0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液 190 mL，用0.05 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至1000 mL。1 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，用水溶解并稀释至100 mL。 0.03 mol/L 氢氧化钠溶液：取1 mol/L 氢氧化钠溶液3mL，用水稀释至100 mL。 Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲液：取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠 10.9 g、乙二胺四乙酸二钠 39.2 g， 加水900mL，用1 mol/L 的氢氧化钠溶液调pH值至5.0±0.2，用水稀释至1000 mL。 洗脱液：：J取甲醇150mL， 加乙酸乙酯150 mL、浓氨水6mL， 混匀。 复溶液：取水40mL， 加甲醇5 mL、乙腈5 mL、甲酸 0.05 mL， 混匀。 2.样品制备 取试样1g(准确至±0.01g)于50 mL 离心管，加入 Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲液8mL，涡旋 1 min，超声20 min， 高速冷冻离心5 min， 收集上清液。 2.1净化 将 HLB固相萃取柱安装在 Fotector Plus 全自动固相萃取仪上，依次用甲醇5 mL、水5mL 活化，取备用液过柱，依次用5mL水和20%甲醇水溶液5 mL淋洗，吹干，用洗脱液10 mL 洗脱。收集洗脱液于EVA-80全自动氮吹浓缩仪中45℃水浴氮气 下层残渣中加磷酸盐缓冲液8mL，重复提取一次，合并两次提取液，混匀，备用。 吹干。加入复溶液1.0mL， 涡旋 1 min 溶解残余物，10000 r/min 离心 5 min， 微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。 具体的固相萃取方法见图3。 2.2 固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 HLB固相萃取柱 (RayCure， 200 mg/6mL) 活化 甲醇、水 淋洗 水、20%甲醇水溶液 洗脱 洗脱液 31658.17.m 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 时间[min) 1 清洗样品通道 CH30H 2.5 2 活化 CH30H 有机废液 2 5 3 3 活化 H20 废水 3 5 2.1 4 上样 有机废液 3 17 6.8 5 清洗样品瓶 磷酸盐缓冲液 有机废液 70 2 1.4 6 淋洗 H20 废水 5 5 1.5 7 淋洗 20%甲醇水溶液 有机废液 5 5 1.5 8 气推 有机废液 80 50 3.4 9 吹干 10 10 清洗注射泵 洗脱液 30 5 0.6 11 洗脱 洗脱液 收集 1 5 5.5 12 洗脱 洗脱液 收集 1 5 5.5 13 气推 收集 5 3 1.1 14 结束 15 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Fotector Plus 固相萃取方法 3.液质检测条件 3.1 液相条件 Column 色谱柱 Eclipse SB C18， 50 mmx2.1 mm， 1.8 um Column oven 柱温 35°C Flow rate 流速 0.3mL/min Injection volume 进样量 5pL 3.2液相梯度洗脱条件 时间/min 流动相A (0.1%甲酸溶液) 流动相B(乙腈) 0.0 95% 5% 2.0 85% 15% 5.0 60% 40% 7.0 5% 95% 7.1 95% 5% 10.0 95% 5% 3.3质谱仪器参数 离子源 电喷雾源 电离模式 多离子反应监测(正)模式 喷雾针压力 35 psi 喷雾加热区电压 1500V 四极杆温度 100°C 干燥气流速 10 L/min 鞘气温度 350°C 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 4000V 300V 3.4 MRM 参数 35 沙拉沙星 386.2 299.1* 70 33 27 342.1 70 20 36 二氟沙星 400.2 299.0 70 37 30 356.1* 70 19 3.5色谱图 四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物标准溶液总离子流图(20g/L) 4.结果与讨论 为了验证该方法的回收率，本实验在空白猪肉样品中加入四环素类、喹诺酮类和磺胺类标准品进行加标回收验证(n=3)，并采用基质标准曲线定量，数据结果如表-2所示。加标回收率在62.4%~105.6% 之间， RSD 值控制在15%以内，满足标准要求，说明该方法能够很好地运用于动物性食品中四环素类、喹诺酮类和磺胺类多残留量的检测。 表-2.猪肉样品加标回收率及 RSD 值 序号 目标物 添加浓度 pg/kg 平均回收率(%) RSD(%) 1 乙酰磺胺 50 70.9 10.5 2 磺胺嘧啶 50 87.3 13.1 3 磺胺噻唑 50 87.2 4.4 4 磺胺吡啶 50 105.6 6.7 5 磺胺甲嘧啶 50 104.3 9.4 6 依诺沙星 50 95.9 6.9 7 麻保沙星 50 103.4 8.7 8 诺氟沙星 50 100.2 10.3 9 氧氟沙星 50 100.5 3.9 10 培氟沙星 50 82.7 10.4 11 土霉素 50 89.3 12.6 12 环丙沙星 50 96.2 4.7 13 达氟沙星 50 77.9 7.0 14 洛美沙星 50 98.6 7.6 15 四环素 50 83.3 6.9 16 磺胺二甲嘧啶 50 88.6 5.0 17 磺胺二甲异嘧啶 50 89.0 5.5 18 磺胺甲噻二唑 50 75.4 11.1 19 恩诺沙星 50 87.6 13.0 20 磺胺对甲氧嘧啶 50 87.1 5.7 21 沙拉沙星 50 87.9 12.1 22 二氟沙星 50 81.9 10.2 23 磺胺间甲氧密度 50 81.9 4.7 24 磺胺甲氧哒嗪 50 85.5 5.7 25 磺胺氯哒嗪 50 79.5 8.1 26 酞磺胺噻唑 50 74.7 11.2 27 金霉素 50 62.4 9.2 28 磺胺间二甲氧嘧啶 50 85.7 4.7 29 磺胺甲噁唑 50 88.7 10.0 30 多西环素 50 64.2 7.4 31 磺胺二甲异噁唑 50 74.3 13.0 32 氟甲喹 50 74.1 7.1 33 噁喹酸 50 77.6 5.9 34 苯甲酰磺胺 50 65.1 9.1 35 磺胺邻二甲氧嘧啶 50 77.7 2.9 36 磺胺苯吡唑 50 71.3 5.8 1.在超声提取步骤时使用冰水浴来进行20min 的超声，可减少由于长时间超声引起的温度升高，而造成目标物的损失。 2.应避免样品在浓缩过程中长时间氮吹、过分浓缩干燥，否则可能会造成回收率损失。 3.本解决方案中EVA 系列全自动平行浓缩仪可以自动完成样品的浓缩，采用氮吹针追随的方式 使得浓缩进程更快，并节省氮气； Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时 Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com热线： 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 本文参考上述标准，试样中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物，用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，使用HLB柱经睿科Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，洗脱液经睿科Raykol EVA 80全自动氮吹仪浓缩，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。