合成原料药中主成分检测方案(超临界色谱)

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SSL-CA20-114Excellence in Science Excellence in ScienceSFC-019 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn Nexera UC Prep 应用于合成原料药的分析和制备 SFC-019 摘要：本文利用岛津 Nexera UC Prep 超临界流体制备色谱系统建立了合成原料药的分析和制备方法。以满足合成原料药快速分析和大量制备纯化的目的。重复性实验结果显示，色谱峰的保留时间 RSD% 为0.18%，峰面积 RSD% 为1.8%，重复性良好。Nexera UC Prep 对合成原料药的制备回收率为80.4%。 关键词： Nexera UC Prep台合成原料药超临界流体色谱 超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromato--graphy， SFC) 是以超临界流体为主要流动相，具有分析速度快、立体选择性好、分离效率高、溶剂消耗少特点的分离技术，已成为手性药物分离和制备的研究新热点。目前，超临界 CO，因其对环境良好，廉价易得， 后处理简单等特点，常用作 SFC 的流动相。 本文利用岛津 Nexera UC Prep 超临界流体制备色谱系统建立了针对合成原料药的快速分析和大量制备纯化的方法，以提升分析和制备效率。 实验部分 1.1仪器 岛津 Nexera LC-40 液相色谱系统。具体配置为LC-40B XR 输液泵， DGU-403在线脱气机， SIL-40C XR自动进样器， CTO-40C 柱温箱， SPD-40V紫外检测器，LabSolutions Ver. 5.98 色谱工作站。 岛津Nexera UC 超临界流体色谱分析系统。具体配置为 LC-30AD SF CO输液泵，LC-30AD 改性剂输液泵，SIL-30AC自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， SPD-M20A二极管阵列检测器，SFC-30A 背压调节器，CBM-20A控制器，LabSolutions Ver. 5.98 色谱工作站。 岛津Nexera UC Prep 超临界流体色谱制备系统。具体配置为 LC-40P SF CO输液泵： LC-20AP改性剂输液泵，FRS-40自动进样器和馏分收集器， CTO-40C柱温箱，SPD-M40二极管阵列检测器， SFC-40P 背压调节器，HEX-40热交换器， CBM-40控制器，LabSolutions Ver. 5.98色谱工作站。 图1 Nexera UC Prep 超临界流体制备色谱系统图 1.2分析条件 HPLC 色谱条件 色谱柱： InertsilODS-3 (150 mm × 4.6mml.D.， 5 um) P/N： 5020-01731， 岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-超纯水B相-乙腈 流速：1.5mL/min 柱温：50℃ 进样量： 10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0 Pump B.Conc 5 10 Pump B.Conc 95 12 Pump B.Conc 95 13 Pump B.Conc 5 15 Controller Stop Nexera UC 色谱条件： 色谱柱： Nexera UC Chiral CC4((150mm × 4.6mm l.D.， 5um) P/N：220-91625-11， 岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-scCO，B相-乙醇 流速： 3.0mL/minBPR压力：10MPa柱温：40℃BPR温度：50℃进样量：1uL洗脱程序：等度洗脱，25%B相 Nexera UC Prep 色谱条件： 色谱柱： Nexera UC Chiral CC44((250 mm × 20 mmI.D.，5 um) P/N：220-97337-24， 岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-scCO，B相-乙醇 流速：94.5 mL/minBPR压力：10 MPa柱温：40℃BPR温度：50℃进样量： 500pL洗脱程序：等度洗脱，25%B相 1.3样品前处理方法 样品储备液：准确称取1.3g合成原料药样品，直接吸取5mL异丙醇，溶解样品，作为样品储备液。 HPLC系统样品测试液：吸取1mL样品储备液，用异丙醇稀释至1mg/mL， 进样10 uL。 Nexera UC 系统样品测试液：吸取1mL样品储备液，用异丙醇稀释并定容至10mL， 进样1 uL。 Nexera UC Prep 系统样夜测试液：吸取3mL样品储备液，用异丙醇稀释并定容至10mL， 进样500uL。 结果与讨论 2.1合成原料药 HPLC色谱图 按照1.3配制成1 mg/mL的合成原料药溶液，上机分析，所得 HPLC色谱图如图2所示，主峰1和杂质峰2分离度良好，色谱峰1出峰时间约为9 min。 图2合成原料药 HPLC 色谱图 2.2合成原料药Nexera UC 测试色谱图 Nexera UC 系统样品测试液所得 SFC 色谱图如图3所示，主峰1和杂质峰2分离度良好，且分析结果显示与 HPLC分离情况匹配，主要色谱峰面积比见表2，并确证了目标色谱峰在 SFC 分析色谱图中的出峰位置。色谱峰1出峰时间约为3.5min， 较HPLC分析， SFC 在保证良好分离度基础上，出峰时间提前，达到快速分析目的，提升分析效率。 表1梯度洗脱时间程序 Peak SFC HPLC 1 74.43% 74.33% 2 16.15% 16.22% 图33合成原料药 SFC 色谱图 2.3合成原料药 Nexera UC Prep 测试色谱图 通过 SFC 和 SFC Prep 色谱柱横截面积，计算 SFC Prep流速为56.7 mL/min，并根据色谱柱柱长差异，调整流速为94.5 mL/min， 且进样量设为500 uL。 Nexera UC Prep 系统样品测试液所得 SFC Prep色谱图如图4所示，主峰1和杂质峰2分离度良好，分析结果显示与 SFC分离情况一致，主要色谱峰面积比见表3。SFC Prep 在快速分析的情况下，流速和进样量大幅增大，，可以满足合成原料药大规模制备纯化要求，快速分析的同时，大量制备纯化。 表3 主要色谱峰面积比 Peak SFC Prep SFC 1 75.85% 74.43% 2 16.18% 16.15% 图4 合成原料药 SFC Prep 色谱图 2.4 Nexera UC Prep 测试重复性考察 Nexera UC Prep 测试重复性结果如下表4所示。色谱峰1和色谱峰2的保留时间 RSD% 分为 0.21%和0.36%，峰面积RSD%分别为1.8%和3.6%，重复性良好。 表4 SC Prep 重复性测试(n=6) 名称 Peakl Peak2 R.T. Area R.T. Area 1 3.57 10208069 8.36 2167231 2 3.56 10301560 8.33 2062976 3 3.57 9954299 8.4 2018029 4 3.58 10409134 8.33 2116172 5 3.57 10398221 8.39 2212913 6 3.56 10052700 8.38 2037156 AVG 3.57 10220663 8.37 2102412 RSD/% 0.21 1.8 0.36 3.6 图5 SFC Prep 重复性测试色谱图 2.5 Nexera UC Prep 制备回收率 针对主峰1进行制备回收率考察，结果如下表5所示，制备回收率为80.4%，且纯度合格，满足要求。 表5 主峰1回收率 Area Recovery Average Initial 299715 N/A N/A Fraction 240804 80.3% 80.4% 241222 80.5% 注： Recovery=Fraction Area/Initial Area*100% Initial：取500 uL Nexera UC Prep 系统样品测试溶液，定容至10mL， 进样1 uL Fraction：色谱峰1馏分定容至10mL， 进样1uL 图6 主峰1制备回收率色谱图 结论 本文采用岛津 Nexera UC Prep 超临界流体制备色谱系统，建立了针对合成原料药的快速分析和大规模制备纯化的方法。重复性实验结果显示，色谱峰的保留时间 RSD% 为0.18%，峰面积 RSD% 为1.8%，重复性良好。 NexeraUC Prep 对合成原料药的制备回收率为80.4%，且纯度合格。相较于 HPLC 常规分析， SFC 具有分析速度快特点，在保证良好分离度情况下， SFC Prep 增大流速和进样量，大大提升分析和制备效率，以满足合成原料药大规模制备纯化的目的。 岛津应用云 本文采用Nexera UC Prep超临界流体制备色谱系统，建立了针对合成原料药的快速分析和大规模制备纯化的方法。重复性实验结果显示，色谱峰的保留时间RSD%为0.18%，峰面积RSD%为1.8%，重复性良好。Nexera UC Prep对合成原料药的制备回收率为80.4%，且纯度合格。相较于HPLC常规分析，SFC具有分析速度快特点，在保证良好分离度情况下，SFC Prep增大流速和进样量，大大提升分析和制备效率，以满足合成原料药大规模制备纯化的目的。