疫苗中蛋白质估算检测方案(TOC分析仪)

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Application No.076News岛津SHIMADZU用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年2月400-650-0439 ApplicationNews 总有机碳分析 岛津TOC-L总氮测量附件TNM-L在药用疫苗蛋白质估算中的应用 No..076 本文介绍了总氮测量法(TNM)作为一种强大的蛋白质估算分析技术在疫苗等生物制药产品中的应用。该研究在浦那的印度血清研究所(Serum Institute of India Pvt. Ltd.) 进行。 氮是氨基酸的基本成分，而氨基酸又是蛋白质的组成部分。氮含量测定已广泛用于药物、食品、饮料和植物材料中蛋白质及其代谢产物的估算。氮通常以有机和无机两种形式存在。无机氮形式包括硝酸盐(NO；)、亚硝酸盐(NO，)和铵 (NH*)。 在药用疫苗生产中，需要在生产周期的初始、中间和最后阶段控制抗原量。因此，会测试病毒疫苗或细菌疫苗各自的减毒或灭活病毒或细菌的数量。这些抗原通常由蛋白质组成，因此总蛋白质的分析定量变得至关重要。白喉、破伤风类毒素与百日咳抗原联合使用作为 DTP 联合疫苗。它可以赋予儿童对白喉、破伤风和百日咳的免疫力。 传统的凯氏定氮法用于疫苗中蛋白质氮的估算。其主要局限性在于蛋白质有不同的氨基酸序列，因此不同蛋白质需要不同的校正因子。另外，这项工作既费时又费力。此外，在高温下使用浓硫酸会对安全和健康造成相当大的危害。 该应用探索了高温燃烧结合化学发光检测技术对有机氮和无机氮的估算。该方法提供了一种快速有效的方式，可通过总氮(TN)分析来监测氮负荷。将结果与实验值(凯氏定氮法)和理论值进行比较。 1总氮测定 含氮化合物的样品在720℃燃烧分解为一氧化氮(NO)。经过冷却和除湿的 NO气体经过化学发光检测器，在检测器内与臭氧反应，生成二氧化氮(NO，)和激发态的二氧化氮(NO，*)。当NO，*返回基态时，会发射辐射，该辐射可通过光电技术测量。检测器信号会产生一个峰值，该峰值与样品中的氮浓度成正比。总氮分析的反应过程如图1所示。 该应用介绍了用传统凯氏定氮法和总氮测量法对 DPT疫苗进行总氮测量的比较研究。 图1总氮测定过程 图2配有 TNM-L的 TOC-L分析仪 实验方法 选择破伤风和白喉类毒素、百日咳毒素和FHA(丝状血凝素)抗原各三个疫苗批次，由在浦那的印度血清研究所对其进行凯氏定氮法和总有机碳/总氮法的比较研究。使用配有TNM-L的 TOC-LceH分析仪进行总氮分析。 如图2所示，通过在配有 TNM-L 的 TOC-L分析仪上分析含有标准氨基酸的样品，成功评估了 TOC 在氮估算中的应用。对总有机碳/总氮技术和凯氏定氮技术进行了比较，结果见表1。 总有机碳/总氮系统的校准是通过使用硝酸钾水标准溶液进行的。分别使用浓度为1000 mg/L 和 500 mg/L的代表性氨基酸L-谷氨酸和L-组氨酸进行回收率研究。 表1氨基酸的总氮测定结果 样品 凯氏氮含量 (mg/L) TOC/TN氮含量(mg/L) %回收率 L-谷氨酸 (1000mg/L) 95.2 91.5 96.11 L-组氨酸 (500 mg/L) 101.6 100.3 98.72 结果和讨论 凯氏定氮法和 TOC/TN 法用于疫苗测定的比较研究结果见表2和表3。 硝酸钾校准曲线呈良好的线性回归，线性相关系数(r)≥0.9997，如图3所示。氨基酸的典型测量数据如图4所示。 通过 TOC/TN 法和凯氏定氮法获得的氨基酸总氮估算结果相当。回收率在100±10%范围内。 表2 TOC/TN 法和凯氏定氮法用于精制破伤风和精制白喉类毒素的氮含量测定结果 样品 批次 TOC/TN 氮含量(mg/L) 凯氏氮含量 (mg/L) 精制破伤风类毒素 批次1 1.496 1.546 精制破伤风类毒素 批次 2 2.160 2.205 精制破伤风类毒素 批次3 1.935 1.991 精制白喉类毒素 批次1 1.481 1.537 精制白喉类毒素 批次2 1.523 1.559 精制白喉类毒素 批次3 1.544 1.587 表3 TOC/TN 法和凯氏定氮法用于精制百日咳毒素和FHA 抗原的氮含量测定结果 样品 批次 TOC/TN 氮含量(mg/L) 凯氏氮含量 (mg/L) 精制百日咳毒素 批次1 71.590 69.100 精制百日咳毒素 批次2 79.220 74.500 精制百日咳毒素 批次3 83.260 76.500 精制 FHA抗原 批次1 86.080 81.600 精制FHA抗原 批次2 35.540 32.900 批次3 94.790 96.600 图3总氮校准曲线 图4氨基酸的总氮测定结果 结论 使用配有 TNM-L 的 TOC-L分析仪，开发出另一种更有效的蛋白质总氮估算方法。所得结果与常规凯氏定氮法相当。 配有 TNM-L的 TOC-L分析仪为蛋白质估算提供了一种省时、安全的方法。因此，基于所研究样品的生成数据，该应用可用于各种含氮药物和生物制药产品 致谢 1)在此，我们感谢“浦那的印度血清研究所”对感兴趣的疫苗进行分析并帮助解释生成的数据，否则，这项研究将无法进行。 2)我们的经销商 M/S Saksham Analytical Instruments Pvt.Ltd.提供了良好的应用和服务支持，在整个研究中受到高度赞赏。 ( 参考文献 ) ( [1] ASTM D8-8 3 -16：一种测定总氮(TN)和总凯氏氮 (TKN)的新方法。 ) 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( http：//www.shimadzu.com.cn ) 使用配有TNM-L的TOC-L分析仪，开发出另一种更有效的蛋白质总氮估算方法。所得结果与常规凯氏定氮法相当。配有TNM-L的TOC-L分析仪为蛋白质估算提供了一种省时、安全的方法。因此，基于所研究样品的生成数据，该应用可用于各种含氮药物和生物制药产品