尿液中β-受体阻滞剂检测方案(超临界色谱)

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Maria Kristina Parr 教授 柏林自由大学 药学院 德国柏林 Edgar Naegele 和 Bernhard Wuest 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 使用超临界流体色谱和质谱测定尿液中的β-受体阻滞剂 应用简报 兴奋剂检测 摘要 本应用简报介绍了利用 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统一一系列极性药物化合物的分离。重点关注所用化合物库中包含的大量β-受体阻滞剂。对于所有β-受体阻滞剂，讨论了线性、检测限(LOD) 和定量限(LOQ)以及保留时间 RSD 和峰面积 RSD 等性能数据。最终，对其中加入β-受体阻滞剂的尿液样品进行了分析。 前言 在被世界反兴奋剂机构(WADA)列为禁用物质的庞大极性化合物库中，有一部分已在 HILIC 条件下得到分析。 在本研究中，利用超临界流体色谱(SFC) 对该化合物系列进行了研究，以评估对此类极性化合物的分析能力以及三重四极杆质谱对它们的检测性能。由于兴奋剂检测分析的样品量很大，因此需要一种快速分析已知兴奋剂化合物的方法。 SFC 凭借其快速分离能力，可以在应对该应用领域中的样品数量方面发挥重要作用。在评估过程中，利用所用化合物库中固有的13种β-受体阻滞剂，测定样品定量分析的典型检测限(LOD)、定量限(LOQ)、保留时间 RSD 和峰面积RSD以及精度和准确度数据。 实验部分 仪器 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统(G4309A)： ( Agilent 1260 Infinity SFC 控制模块 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 二元泵 ) ( Agilent 1260 Infinity 高性能脱 气机 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 标准 自动进样器 ) ( Agilent 1260 Infinity 柱温箱 ) ( Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器，配备高压 SFC 流通池 ) ( 采用安捷伦喷射流技术的 Agilent 6460三重四极杆液质联 用系统 (G6460C) ) ( Agilent 1260 Infinity 等度泵 (G1310B) ) 安捷伦分流器套装 G4309-68715 仪器设置 图1显示了 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统与 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统的推荐配置。 标准品 化合物库由极性药物化合物组成，其中包括13种β-受体阻滞剂，每种化合物浓度分别为1 mg/mL， 溶于乙腈中。用甲醇制得1：100 的稀释液，配制用于所述研究的储备液。 化学品 所有化学品均购自 Sigma-Aldrich(Taufkirchen， Germany)。所有溶剂均为LC/MS级。甲醇购自德国 J.T. Baker公司。新制超纯水产自配置 LC-PakPolisher 和 0.22 um 膜式终端过滤器(Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统。 样品前处理 向尿液中加入喷布洛尔(250 ng/mL)，用甲醇按 1：5 的比例进行稀释，涡旋混合，然后在14000g 下离心5分钟。对上清液进行过滤，并将滤液直接进样分析。 SFC方法 参数 值 电离模式 正离子 毛细管电压 2500V 喷嘴电压 2000V 气体流速 8 L/min 气体温度 220°℃ 鞘气流速 12L/min 鞘气温度 380°℃ 雾化器压力 25 psi 柱温 40°℃ 进样量 5pL，定量环过量填充三倍 表1.用于研究β-受体阻滞剂的 MRM 条件，列出了母离子质量数、碎片离子质量数以及碎裂电压和碰撞能量 母离子(m/z) 碎裂电压(V) 定量离子 CE (V) 定性离子 CE (V) 喷布洛尔 292 113 236 12 74 20 阿普洛尔 250 11 116 16 56 28 氧烯洛尔 266 113 116 12 72 16 比索洛尔 326 141 116 16 74 28 艾司洛尔 296 121 145 24 56 32 心得安 260 95 116 16 56 28 塞利洛尔 380 136 251 20 74 32 醋丁洛尔 337 145 116 20 56 28 奈必洛尔 406 151 151 28 44 44 心得乐 249 110 116 16 56 28 索他洛尔 273 83 255 8 133 28 阿替洛尔 267 110 145 28 56 28 纳多洛尔 310 88 254 12 56 36 结果与讨论 在氨基色谱柱上，采用甲醇(含0.1%FA)作为改性剂，梯度从2%开始并在10分钟内增加至最高50%，对44种药勿混合化合物中固有的13种β-受体阻滞剂进行分离。在该梯度条件下，所有44种化合物均可得到分离。在本例中，仅监测并详细讨论13种β-受体阻滞剂(图2)。 这些β-受体阻滞剂在4.68至7.38分钟之间洗脱，共洗脱效应极小。药物混合物中第一种洗脱的化合物在保留时间2.27分钟处洗脱，最后一种洗脱的化合物在8.19分钟洗脱。 绘制所有β-受体阻滞剂 1000 ng/mL至1ng/mL(在改性剂中)的校准曲线，以测量线性、LOQ (S/N> 10) 和 LOD (S/N>3)(表2)。典型 LOD 低于1.5 ng/mL， 典型 LOQ 低于 5 ng/mL.所有化合物均获得了线性校准，R²优于 0.9990. 将浓度为100 ng/mL的校准标样进样分析10次，便于统计评估(表2)。测得的保留时间 RSD 通常低于0.25%，峰面积 RSD 低于5%。 图2.包含44种化合物的混合物中13种β-受体阻滞剂的分离。用于分离所有化合物的梯度为：甲醇含量在10分钟内从2%增加至50%。最早洗脱的化合物保留时间为 2.270分钟，最晚洗脱的化合物保留时间为8.198分钟。β-受体阻滞剂在4.68至7.38分钟之间洗脱 表2.13种β-受体阻滞剂的保留时间、保留时间和峰面积的 RSD 以及 LOD、LOQ和线性。利用1至1000 ng/mL 之间绘制的校准曲线计算得到 LOD 和 LOQ。将浓度为 100 ng/mL 的校准标样进行分析10次，由此计算得出 RSD 化合物 RT (min) RT RSD (%) 峰面积RSD (%) ) LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL) ) R2 喷布洛尔 4.680 0.18 3.54 0.20 1.60 0.9994 阿普洛尔 4.784 0.16 4.42 1.50 5.00 0.9990 氧烯洛尔 4.912 0.16 2.76 0.10 0.25 0.9992 比索洛尔 5.045 0.15 3.00 0.19 0.60 0.9991 艾司洛尔 5.111 0.15 6.83 1.41 4.71 0.9992 心得安 5.611 0.18 8.05 1.71 5.70 0.9997 塞利洛尔 6.158 0.26 3.29 0.37 1.25 0.9998 醋丁洛尔 6.397 0.26 1.68 0.66 2.19 0.9997 奈必洛尔 6.463 0.24 5.31 2.85 9.52 0.9996 心得乐 6.854 0.28 3.67 3.64 10.90 0.9994 索他洛尔 7.088 0.24 6.29 5.51 18.38 0.9995 阿替洛尔 7.322 0.28 3.73 1.98 6.66 0.9995 纳多洛尔 7.383 0.29 2.53 0.41 1.38 0.9997 作为实际样品的示例，将喷布洛尔以250 ng/mL 的浓度加入尿液中，并按照‘“实验部分”所述的步骤进行样品前处理。由于纯水溶液样品不能进样至 SFC中，因此用甲醇按1：5 的比例对样品进行稀释。为定量测定喷布洛尔，绘制溶剂中浓度为1000 ng/mL至2ng/mL 范围内的校准曲线(图3A)。测得稀释样品的平均浓度 为45.59 ng/mL， 测得的样品浓度为 228.45 ng/mL。该化合物在4.53分钟洗脱，获得了良好的信号强度(图3B)，且定量/定性离子比处于预期范围内(图3C)。为进行统计评估，将样品进样分析10次，计算得出的保留时间RSD 和峰面积 RSD 分别为0.14%和2.29%。计算得出的浓度精度和准确度分别为2.28%和91.38%。 图3.尿液中喷布洛尔的测定。A)喷布洛尔在2至1000 ng/mL 之间的校准曲线。稀释样品中测得的浓度如箭头所示。B)稀释样品中喷布洛尔的定量离子对。C)所测样品的定量/定性离子比。D)样品中测得的喷布洛尔的 MRM 离子对。内插表格中示出由样品进样分析10次计算得出的保留时间 RSD 和峰面积 RSD 以及平均浓度、浓度精度和浓度准确度 本应用简报证明利用 SFC能够在较短的运行时间内分离大量高极性药物化合物。将 SFC 与三重四极杆质谱仪结合使用所得的检测结果表明，检测限通常低于 1.5 ng/mL。保留时间 RSD低于 0.25%， 峰面积 RSD 低于5%。 结果证明，通过用有机溶剂稀释实际水溶液样品，能够对样品中的药物化合物进行测量，并获得足够高的灵敏度以及浓度精度和准确度。 ( 参考文献 ) ( 1. The World Anti-Doping Code， The 2015 Prohibited List International Standard， World Anti- D opingAgency， Montreal， Canada， 20 September 2014， Available at www.wada-ama.org (2015年 11月1日访问) ) ( 2. Mazzarino，M.； et al. Screeningand confirmation analysis of stimulants， narcotics and beta- adrenic agents in human urineby hydrophobic interaction liquidchromatography coupled to mass spectrometry. Journal of Chromatography A 2011，1218， 8156-8167 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 用于司法鉴定。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年10月15日，中国出版 5991-6437ZHCN Agilent Technologies 本应用证明利用 SFC 能够在较短的运行时间内分离大量高极性药物化合物。将 SFC 与三重四极杆质谱仪结合使用所得的检测结果表明，检测限通常低于 1.5 ng/mL。保留时间 RSD低于 0.25%，峰面积 RSD 低于 5%。结果证明，通过用有机溶剂稀释实际水溶液样品，能够对样品中的药物化合物进行测量，并获得足够高的灵敏度以及浓度精度和准确度。