人血清中维生素A含量检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA20-735Excellence in Science Excellence in ScienceLC-266 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.，LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 使用岛津On-line HPLC 生物样品分析系统快速检测人血清中维生素A含量 LC-266 摘要：本文使用岛津 On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sense for BA， 建立了快速检测人血清中维生素 A含量的测定方法。该方法在5 min 内即可完成血清样品处理及检测，维生素A的检出限可达1 ng/mL， 在10- 1000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数r大于0.9999。低、中、高三浓度加标样品精密度实验结果显示保留时间 RSD 小于0.15%，峰面积及测定浓度的 RSD 小于1.2%，三浓度样品加标回收率均匀95%-105%之间。实验结果表明，该方法能快速稳定准确地测定人血清中维生素A的含量。 关键词： On-line HPLC Co-Sense for BA 血清 维生素A 维生素A是维持人体正常代谢功能所必需的脂溶性维生素，其缺乏或过量均可导致相应疾病。近年来的研究发现，维生素A与儿童的生长发育及一些营养代谢疾病有密切关系。因此，建立测定人血中维生素A含量对于与维生素相关疾病的临床预防、诊断、治疗具有重要的意义。 维生素A常用的检测方法是 HPLC法，其样品前处理需采用蛋白沉淀结合液液萃取的方式进行样品处理，所需样品量大、前处理复杂耗时，成本较高，且 难以实现样品前处理自动化。 岛津On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sensefor BA 是一套采用在线除蛋白及分析物捕集-分离-定量检测的二维液相色谱系统。本文使用上述分析系统，建立了快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法中，血清样品仅需蛋白沉淀后即可进样检测，在5 min 内完成血清样品处理及检测，所需样品量少，样品预处理简单快速可自动化批量处理，成本低廉，操作简单，适用于临床大规模样品检测需求。 系统控制器：CBM-20A自动进样器：SIL-20A HT输液泵：LC-20AT XR脱气机： DGU-20A 3R检测器：SPD-20A柱温箱： CTO-20A色谱工作站： Labsolutions Ver.5.98 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack GIST (100 mm × 3 mm 1.D.，3 um，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-30009-05) SPE前处理柱： Shim-pack MAYI-ODS (10 mm × 4.6mm I.D.， 50 um，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：228-40835-91) 流动相A： 50%甲醇水 流动相B：95%甲醇水 流速：泵A2mL/min， 柱温：40℃ 泵B0.8 mL/min 进 样 体 积 ： 5 0 u L 检测波长：325nm 洗脱方式：等度洗脱，切换阀初始值为0，时间程序如表1所示。 表1 阀切换时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 操作状态 Initial 柱温箱 切换阀 0 除蛋白、捕集 1.00 柱温箱 切换阀 1 样品分析 4.00 柱温箱 切换阀 0 再平衡 5.00 控制器 Stop 1.3标准品溶液及加标血清样品配制 标准品中间液制备：取2000 ug/mL 维生素A母液，用甲醇稀释至50 ug/mL， 冻存备用。 校准曲线工作液制备：取上述中间液，用甲醇逐级稀释制备浓度为10，20，50，100，200，500，1000ng/mL校准曲线工作溶液，避光冷藏。 加标工作液制备：取上述中间液，用甲醇逐级稀释制备浓度为1250，2500， 5000 ng/mL 的加标工作溶液，避光冷藏。 加标血清样品制备：取100uL血清样品，各取上述加标工作液 10 uL， 涡旋 2 min 即得，冷藏备用。 1.4样品前处理方法 取血清样品，涡旋混匀，精密吸取100uL， 置1.5mL离心管中，加入400 uL甲醇，涡旋混匀2min， 静置1 min 后，14000 rpm离心5分钟，取上清液进样分析。 结果与讨论 2.1检出限 配制1ng/mL标准品溶液，进样检测，其色谱图如图2所示， 以 ASTM 方式计算得到的 S/N 为7.76，以此数据计算得到的检出限为 0.5 ng/mL。 图2 1ng/mL标准品溶液色谱图 2.2系统残留 进样1000 ng/mL标准品溶液后，进样空白甲醇溶剂，得到如下色谱图，结果显示，维生素A无系统残留。 图3 甲醇溶剂色谱图 2.3线性关系 进样检测10，20，50，100，200，500，1000 ng/mL校准曲线溶液，结果如下所示。 图4 标准曲线 2.4精密度考察 使用配制的低、中、高浓度加标血清样品，进行精密度实验，其结果如下表所示。 表2 加标血清样品精密度实验结果(n=5) 序号 25ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 2.967 66，969 2.961 79，296 2.957 103，357 2 2.960 67，280 2.966 80，031 2.962 103，201 3 2.955 66，932 2.958 79，495 2.968 103，015 4 2.960 67，490 2.959 79，662 2.965 102，965 5 2.957 67，136 2.965 79，849 2.960 102，912 平均值 2.960 67161 2.962 79667 2.962 103090 RSD(%) 0.15% 0.34% 0.12% 0.36% 0.14% 0.18% 2.5加标回收率 使用血清样品及用其配制的低、中、高浓度加标血清样品，各平行制备2份上机样品，进行加标回收率实验，其结果如下表所示。 表3 加标回收率实验结果 血清 加标 25 ng/mL 加标50 ng/mL 加标100 ng/mL 1号样 2号样 1号样 2号样 1号样 2号样 1号样 2号样 浓度 (ng/mL) 104.043 104.542 131.253 128.797 155.316 157.142 203.735 205.449 平均值(ng/mL) 104.293 130.025 156.229 204.592 回收率 - 102.9% 103.9% 100.3% 2.6样品测定 取人血清样品，按照1.4中样品前处理方法平行处理3份样品，上机检测，结果如下。 图5 血清样品维生素A色谱图 表4 血清样品维生素A检测结果 血样1 血样2 血样3 x±s 浓度 (ng/mL) 106.243 105.503 105.043 105.596±0.605 结论 本文使用岛津 On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sense for BA， 建立了快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法在5 min 内即可完成血清样品处理及检测，方法验证结果表明，该方法灵敏度高、稳定性好，可以简便快速准确地测定人血清中维生素A的含量，，可满足自动快速高通量检测的临床实际需求，适用于大规模临床样本的检测。 岛津应用云 本文使用岛津On-line HPLC生物样品分析系统Co-Sense for BA，建立了快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法在5 min内即可完成血清样品处理及检测，方法验证结果表明，该方法灵敏度高、稳定性好，可以简便快速准确地测定人血清中维生素A的含量，可满足自动快速高通量检测的临床实际需求，适用于大规模临床样本的检测。