酒黄精中黄精提取液水解产物的含量测定 高效液相色谱法

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一、 摘要 本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定酒黄精中黄精多糖水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量。色谱条件：C18色谱柱， 4.6×250mm，5μm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为254nm。实验结果：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为1.02~1.20；重复性测试中，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的RSD范围为0.072~0.210%，峰面积的RSD范围为0.578~0.780%；在测定浓度范围内，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖均具有良好的线性关系，确定系数R2均大于0.999；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为0.013µg/mL~0.041µg/mL，仪器定量限范围为0.043µg/mL~0.137µg/mL；酒黄精样品中多糖水解产物甘露糖的含量为6.067mg/g，葡萄糖的含量为72.250mg/g，半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为0.839mg/g。因此，K2025满足酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定需求。二、 背景黄精是一种滋补类中药，有抗炎、抗菌作用，能够治疗伤寒以及感染性腹泻，也能够抗氧化，减少心肌缺血，保护心血管，保护心脏功能。黄精还可以降低血糖，减少疲劳感，延缓衰老，增加机体免疫力，强筋健骨，对于亚健康状态，具有很好补益作用。其中，黄精多糖的生物活性主要在免疫调节、抗氧化、降血糖、抗炎、抗肿瘤等方面。文档编号： LC-K2025-01-221001 酒黄精中黄精提取液水解产物的含量测定高效液相色谱法 一、摘要 本文使用悟空 K2025 高效液相色谱仪测定酒黄精中黄精多糖水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量。色谱条件： C18色谱柱， 4.6×250mm， 5mm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10mL， 检测波长为 254nm。实验结果：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为1.02~1.20；重复性测试中，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的 RSD 范围为 0.072~0.210%，峰面积的 RSD 范围为0.578~0.780%；在测定浓度范围内，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖均具有良好的线性关系，确定系数R'均大于0.999：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为 0.013Hg/mL~0.041Hg/mL，仪器定量限范围为0.043Hg/mL~0.137Hg/mL；酒黄精样品中多糖水解产物甘露糖的含量为6.067mg/g，，葡萄糖的含量为72.250mg/g， 半乳糖的含量为3.436mg/g， 木糖的含量为0.839mg/g。因此， K2025满足酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定需求。 二、背景 黄精是一种滋补类中药，有抗炎、抗菌作用，能够治疗伤寒以及感染性腹泻，也能够抗氧化，减少心肌缺血，保护心血管，保护心脏功能。黄精还可以降低血糖，减少疲劳感，延缓衰老，增加机体免疫力，强筋健骨，对于亚健康状态，具有很好补益作用。其中，黄精多糖的生物活性主要在免疫调节、抗氧化、降血糖、抗炎、抗肿瘤等方面。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 三、实验过程 1范围 适用于酒黄精中黄精多糖水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定。 2原理 样品经三氟乙酸提取后由黄精多糖水解为单糖，水解液中的单糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生反应， Cig色谱柱分离，衍生物在254nm有紫外吸收，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。 3试剂与材料 3.1水：符合GB/T 6682 的一级水； 3.2磷酸二氢钾：分析纯； 3.3氢氧化钾：分析纯； 3.4乙腈：色谱纯； 3.5流动相：A相： 0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(称取6.8g磷酸二氢钾(3.2)，加入 1000mL水，用KOH 溶液调pH至6.80)；B相：乙腈； 3.6三氟乙酸：分析纯； 3.7 2mol/L 三氟乙酸溶液：称取 11.4g三氟乙酸(3.6)，加50mL水，混匀； 3.8氢氧化钠：分析纯； 3.9 2mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(3.8) 4g， 加50mL水，混匀； 2 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 3.10 0.3mol/L氢氧化钠溶液：取2mol/L氢氧化钠溶液(3.9) 6mL，加入34mL水，混匀； 3.111-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)：分析纯； 3.12 0.5mol/L PMP 甲醇溶液：称取4.3gPMP(3.11)，加50mL甲醇； 3.13盐酸：分析纯； 3.14 0.3mol/L 盐酸溶液：取盐酸(3.13)1.25mL， 加48.75mL水，混匀； 3.15三氯甲烷：分析纯； 3.16甘露糖对照品： CAS号：3458-28-4，纯度为99.8%； 3.17甘露糖标准储备液：取一定量的甘露糖对照品(3.16)，用水配制成浓度为1mg/mL的标准储备液； 3.18葡萄糖对照品： CAS号：50-99-7，纯度为98.6%； 3.19葡萄糖标准储备液：取一定量的葡萄糖对照品(3.18)，用水配制成浓度为1mg/mL的标准储备液； 3.20半乳糖对照品： CAS号：59-23-4，纯度为99.9%； 3.21半乳糖标准储备液：取一定量的半乳糖对照品(3.20)，用水配制成浓度为1mg/mL的标准储备液； 3.22木糖对照品： CAS号：58-86-6，纯度为 99.9%； 3.23木糖标准储备液：取一定量的木糖对照品(3.22)，用水配制成浓度为1mg/mL的标准储备液； 3.24混合标准溶液：分别移取一定量的甘露糖标准储备液(3.17)、葡萄糖标准储备液(3.19)、半乳糖标准储备液(3.21)、木糖标准储备液(3.23)，用水稀释，配制成浓度均为250g/mL *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 的混合标准溶液； 3.25微孔滤膜：：0.22Hm，有机相。 4仪器与设备 4.1高效液相色谱仪：K2025P2二元高压输液泵、K2025 AS 自动进样器、K2025 CO 柱温箱、K2025 UVD 紫外-可见光检测器、Wookinglab 色谱工作站； 4.2分析天平：精确到0.0001g； 4.3涡旋振荡器； 4.4超声波清洗机； 4.5pH计：精确到 0.01； 4.6高速离心机； 4.7容量瓶：：10mL，棕色带刻度。 5测定步骤 5.1样品前处理 将酒黄精样品研细，准确称取约1.0g，置于10mL容量瓶中，加2mol/L三氟乙酸溶液(3.7)约4mL，80℃超声提取2h，放冷，用2mol/L氢氧化钠溶液(3.9)调pH至中性，加水定容至刻度线，摇匀，以4000r/min的转速离心5min，取上清液，过0.22Hm滤膜。 5.2衍生化处理 分别取经5.1处理后的酒黄精样品及混合标准溶液(3.24) 200pL于2mL避光离心管中，加入 0.5mol/LPMP 甲醇溶液(3.12)200mL， 再加入0.3mol/L氢氧化钠溶液(3.10)4 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 200mL，混匀。避光条件下70℃水浴 1h， 放置室温10min， 加入 0.3mol/L 盐酸溶液(3.14)200mL，混匀。加入1mL三氯甲烷(3.15)，充分萃取后，除去三氯甲烷层(下层)，用三氯甲烷反复萃取3次，取上层清液，加水200pL， 过0.22lm 滤膜。 5.3混合标准系列工作液配制 取适量经(5.2)衍生后的混合标准溶液(3.24)，分别用水稀释成浓度依次为2.500g/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ug/mL的标准系列工作液。 5.4色谱条件 a)色谱柱：C色谱柱，4.6×250mm， 5mm或者相当的色谱柱； b)流动相：：详见3.5； 梯度洗脱程序如下： 时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0.0 17 83 5.0 18 82 10.0 19 81 30.0 20 80 35.0 17 83 40.0 17 83 c)流速：11.0mL/min： d) 进样量：10uL； e)柱温：25℃； *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 f)检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。 6结果 6.1重复性测试 按照上述色谱条件(5.4)进行采集，混合标准工作液(浓度为 10Hg/mL)的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。 图1混合标准工作液的色谱图 表1混合标准工作液色谱图积分结果 目标物 保留时间 峰面积 峰高 理论塔板数 分离度 对称/拖尾因子 (min) (mAU.s) (mAU) 甘露糖 16.133 580.336 30.578 17719 厂 1.20 葡萄糖 28.583 446.364 12.441 15619 17.80 1.15 半乳糖 31.467 946.218 25.194 16173 3.03 1.13 木糖 33.117 390.434 10.086 16999 1.65 1.02 6 ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) 由表1中数据可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为1.02~1.20。 将混合标准工作液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。 图2混合标准工作液连续进样7针叠加的色谱图 表2混合标准工作液连续进样7针重复性数据统计 目标物 1 2 3 4 5 6 7 平均值 RSD% 甘露糖 保留时间 16.133 16.108 16.100 16.100 16.108 16.100 16.108 16.108 0.072 峰面积 580.336 570.779 572.546 578.113 577.286 574.809 574.236 575.444 0.578 葡萄糖 保留时间 28.583 28.625 28.633 28.625 28.583 28.750 28.600 28.628 0.200 峰面积 446.364 437.784 439.410 445.053 446.463 444.697 441.910 443.097 0.780 半乳糖 保留时间 31.467 31.525 31.525 31.525 31.483 31.667 31.492 31.526 0.210 峰面积 946.218 931.213 934.049 944.577 944.366 941.475 938.041 939.991 0.610 木糖 保留时间 33.117 33.175 33.183 33.183 33.142 33.317 33.142 33.180 0.197 峰面积 390.434 384.171 384.626 389.297 388.549 387.459 386.075 387.230 0.613 由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保 ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 留时间的 RSD 范围为 0.072~0.210%，峰面积的 RSD 范围为 0.578~0.780%，均具有良好的定性定量重复性。 6.2仪器灵敏度测试 灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果见表3。 图3仪器灵敏度的色谱图 表3仪器灵敏度测试数据 目标物 浓度 峰高 噪声 LOD LOQ S/N (ng/mL) (mAU) (mAU) (ng/mL) (ng/mL) 甘露糖 2.500 7.482 0.013 575.5 0.013 0.043 葡萄糖 2.500 2.955 0.013 227.3 0.033 0.110 半乳糖 2.500 6.097 0.013 469.0 0.016 0.053 木糖 2.500 2.367 0.013 182.1 0.041 0.137 由表3中数据可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为 0.013Hg/mL~0.041Hg/mL，仪器定量限范围为 0.043Hg/mL~0.137Hg/mL。 6.3含量测定 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 6.3.1校准曲线 将配制好的标准系列工作液(5.3)在 HPLC 上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及确定系数见图4~图7，叠加色谱图见图8. 图4甘露糖标准工作液的校准曲线 葡萄糖 图5葡萄糖标准工作液的校准曲线 Q ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) 图6半乳糖标准工作液的校准曲线 图7木糖标准工作液的校准曲线 ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) 图8混合标准工作液浓度系列叠加色谱图 由图4~图7可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R'均在0.999 以上。 6.3.2样品含量测定 以酒黄精为样品，按照5.1~5.2的流程对样品进行处理，并计算样品中多糖水解产物的含量。按照公式(1)进行计算，样品的色谱图如图9所示。 式中：w----为样品中多糖水解后甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量，单位为毫克每克(mg/g)； C----为通过校准曲线计算的样品中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)； V----为样品的定容体积，单位为毫升(mL)； m--为样品质量，单位为克(g)； f-----为稀释倍数； 1000----为换算系数。 ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) 图9酒黄精样品的色谱图 经计算，此酒黄精样品中甘露糖的含量为 6.067mg/g，葡萄糖的含量为 72.250mg/g，半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为0.839mg/g。 7结论 通过对甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性的测试以及对酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量进行测定，实验结果表明：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为1.02~1.20；重复性测试中，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的 RSD 范围为0.072~0.210%，峰面积的 RSD 范围为 0.578~0.780%，均具有良好的定性定量重复性；在测定浓度范围内，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖均具有良好的线性关系，确定系数R'均大于0.999；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为 0.013Hg/mL~0.041Hg/mL， 仪器定量限范围为0.043Hg/mL~0.137Hg/mL；酒黄精样品提取液水解产物甘露糖的含量为6.067mg/g，葡萄糖的含量为 72.250mg/g， 半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为 0.839mg/g。因此，Wooking K2025 高效液相色谱仪可以满足酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄12 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 糖、半乳糖、木糖的含量测定需求。 ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) 附1：仪器配置清单 序号 单元 K2025 二元高压梯度系统 A) Pump Unit 泵单元 1 62MPa 二元高压输液泵(内置溶剂托盘) 2 流动相瓶(肖特瓶，1L) 3 脱气机 4 四通道溶剂切换阀 5 自动在线清洗系统 B) Sample Injector 进样器 1 自动进样器 2 样品瓶(2mL，含瓶盖) 3 脱气组件4 100从L定量环 C) Column Oven 柱温箱1 色谱柱恒温箱(室温以下10℃至85℃)2 色谱柱： Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm， 5Hm D) Detector 检测器 1 紫外-可见光检测器 E) Workstation 工作站 1 Wookinglab (中文版) *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 附2：悟空 WookingK2025 高效液相色谱仪(可靠、精准、友好、合规) ( *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 ) ( *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 ) /