【讨论】大家帮忙看看我这个分子量小于10000的混合小肽检测方法有什么问题

你的实验过程写的很详细，这样好分析。

如果你的样品在现有的流动相中不能全溶，可以试试降低乙腈的含量。（不太明白为什么要用乙腈，蛋白类物质应该可以用盐溶液直接溶解的。）

你的目标小肽的分子量在“主要集中在2000-300，少量在3000-5000”范围内，那你不应该选用G3000SWXL柱，该柱子的分离范围（球型分子）是1万到50万，大了，所以标准曲线有问题是正常的。
选用G2000SWXL能好些，它的分离范围是：5000到1.5万。
能分析分子量到几百的凝胶一般选用：SephadexG-15或G-10等。

这个时候最好用示差检测器；
对于分子量如此小，我没有使用过多角度光散射检测器，不知道能否用。

说明你的实验条件不合适：稳定性太差；解决方法——调整实验条件直至实验稳定。

谢谢楼上各位的回复。

我的柱子写错了。不是3000，是2000。我已经更正了。

我也觉得乙腈的比例太大。当初参考的方法流动相是乙腈-水（0.1％三氟乙酸）＝10：90的，不过用这种流动相条件进样，5个混合标准品根本就分不开。所以来给作方法的老师就给调整成了45：55了。

我以前没作过蛋白的液相，不过样品处理时就觉得不对劲：加上流动相后明显看出样品不能溶解性比较差，根本就没有考虑过滤时不溶部分的损失。
不过因为不熟悉凝胶柱，没敢随便调整流动相组成。

TSK-GEL SW型填料性能和分离范围


这里的流动相一般为盐溶液。

所以要分离你的五个标样，TSK-GEL系列的柱子在用水溶液（盐溶液）作流动相是不能分开的。而调整为有机溶液做流动相是可以分开的，但可能不完全再以分子筛的原理来分离的。——所以你的标准曲线有两个点相差较多。

最好换柱子。

参考许多资料，好像作反相C18柱作蛋白含量的流动相大多采用乙腈-水（0.1％三氟乙酸）＝10：90的，估计当初开发方法时就参考的这类材料。

我的样品水溶性并不很好，但是在碱液中易溶，所以我也考虑用缓冲盐来试试。但是不知道tsk的这种凝胶柱用什么样的缓冲盐效果比较好？

谢谢。
可是我看了一些凝胶柱，根据我的样品综合考虑，好像就现在这种柱子算是最适合了。
能不能推荐一下。。。。

lxdongzi2003 发表:TSK-GEL SW型填料性能和分离范围


这里的流动相一般为盐溶液。

所以要分离你的五个标样，TSK-GEL系列的柱子在用水溶液（盐溶液）作流动相是不能分开的。而调整为有机溶液做流动相是可以分开的，但可能不完全再以分子筛的原理来分离的。——所以你的标准曲线有两个点相差较多。

最好换柱子。

搂主可能对液相色谱比较熟，其实一般蛋白质就用水加少量盐即可作溶剂/流动相，如果样品溶解不好，可以考虑换一种盐以便解蒂和（aggregation），蛋白质样品往往蒂和较多。或者适当升温，甚至50--60摄氏度，也可得到较好的谱图。在GPC中，升温往往被忽略，特别是水相的应用。不过最好还是先确定方法，或查文献找方法。否则自己摸索方法很费劲。
如果样品溶解不好，那么做GPC就没有太大意义了。
带光散射检测器，需要示差折光仪以便测定dn/dc值以计算分子量，尤其是多角外推法，否则查找dn/dc值也很麻烦。waters的示差折光检测器也不能测dn/dc值。
现在测到的分子量虽然小，但是不一定是绝对分子量！因为样品可能有支化。所以可能用光散射测到的绝对分子量很大呢。
另外，色谱柱也是方法的一部分，一般GPC柱分为水相和有机相的两大类，水相柱也分为一般水相、阳离子型、阴离子型等几种。如果像HPLC那样用乙腈和水混合溶液做流动相，那么可能会对水相柱的寿命和效果有影响，所以最好是要么用有机溶剂/流动相，要么就用水和无机盐做溶剂/流动相。