WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）试用稿

DX0299

2005/01/30

私聊

液相色谱（LC）

WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）试用稿
制定人：适用于本教研室所有使用此仪器者
1 流动相的处理
1.1 过滤溶剂
溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用1-2ml甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
1.2 保持储液瓶的清洁
用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。
1.3 保证溶剂的质量
一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。
1.4 故障及解决方法
1.4.1 流动相脱气不充分
流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。
1.4.2 流动相供给不畅
流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。
过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。
流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10ml/min，常会出现这种现象。使用下列方法解决：（1）使用低流速；（2）换大孔径的过滤器；（3）增加进液管道内径；（4）抬高或加压储液器；（5）不用过滤器，但流动相一定要先过滤；（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；（7）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。
1.4.3 流动相和储液器被污染
由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。
脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。
流动相污染来自这几个方面：试剂质量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影响；配制流动相时操作不当等。因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。玻璃器皿按规定清洗干净。为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统。怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统）
真空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。
2仪器组成及电源
本系统可进行多达四元溶剂的梯度洗脱操作
2.1 仪器组成本系统由Waters 600E 多溶剂输送系统，四通道在线过滤，7725i进样器，996型二极管阵列检测器，联想品牌机等单元组合而成。
2.2 电源仪器使用时按泵、检测器、打印机和计算机的顺序，依次接通电源。
3 600E高压输液泵的操作
3.1 液相色谱系统泵的流速在0.1-10.0ml/min之间，要保持泵的良好操作性能，必须维护系统的清洁，保证溶剂和试剂的质量，流动相的过滤和流动相的脱气。下面列出预防泵故障的注意事项：（1）用高质量的试剂和HPLC级溶剂；（2）过滤流动相和溶剂；（3）脱气；（4）工作时使用泵头的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶剂冲洗柱塞杆；（5）不让水和腐蚀性溶剂滞留在泵中；（6）定期更换垫圈；（7）加润滑油。处于良好操作状态的泵，应该使色谱图上的基线平稳，保留时间的重复性良好。等度洗脱时压力波动小于±2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
3.2 常规准备工作包括：开通电源，溶剂脱气，泵头及溶剂管路除气泡及泵的启动。
3.2.1 接通系统电源，控制器开通后进行自检，数秒后通过，接受操作指令。
3.2.2 溶剂瓶脱气打开四通道在线过滤器，脱气15min。
3.2.3 系统中气泡的排除泵启动时，调节所需要的通道流速为1ml/min，该通道如A调节为100%。将抽液阀旋至draw位，用针筒抽A液10ml，将抽液阀旋至inject位，并推出针筒中的液体，将抽液阀旋至run位。此时参比阀排出的液体应连续，如不连续则重复以上抽液排液操作。重复以上操作分别抽取B，C，D液10ml。将流速减小至0.2ml/min，将参比阀关闭。柱前气泡如不能排除，则管路在不与色谱柱连接的情况下，提高流速至9ml/min，数分钟后将流速减至1ml/min。
3.3 等度（Isocratic）操作按direct键，进入isocratic菜单。依次设定流路配比，氦气流速，柱温。设定方法如下：按光标移动键，至闪烁光标出现在所需设定位置上。用数字键设定数值，按enter键确认，注意每个流动相其组成之和应为100%，设定流速为0.1ml/min，逐渐增加流速至实验所需的流量，待系统平衡后开始实验。
3.4 梯度（Gradient）洗脱操作梯度洗脱需要编制梯度表和程序事件（Program event）表，在OPERATE GRADIENT屏幕时运行。按program method键，进入梯度编辑窗口。移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键，将光标移至梯度表第一行，依次输入流速和流量配比，分别按enter键确认。光标移至第二行，依次输入梯度时间，流速，配比及曲线号(1-11)，重复以上操作，至梯度表全部编完，按显示屏对应功能键save，并记住table #。按Program event键，进入程序事件表的编制，移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键，将光标移至事件表第一行，依次输入事件号(1-10)和开关，按enter键确认，光标移至第二行，依次输入事件时间，事件号，和开关，按enter键确认，重复以上过程至事件表完成，按save键储存。
3.5 梯度程序的运行按operate methods键，进入梯度方法运行窗口，将光标移至table处，输入欲运行的表号(1-15)，按显示屏对应功能键start run，运行。在设置时，如有疑问，可用HELP提示每个设置的含义。
3.6 实验结束对泵进行冲洗后，关闭流量，注意流速必须要逐步变化。冲洗顺序:如果使用有缓冲液的流动相，则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。同时用清水清洗柱塞杆。若停泵存放时间超过一天，则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。
3.7 关闭电源开关。
4 进样
4.1 采用7725i手动进样器，进样环（loop）体积为20μl，上样量在10~20μl时，进样体积必须大于loop体积的3-5倍，才能得到好的重现性，上样量小于10μl时，可以用10μl的微量进样器直接进样。进样后，快速旋转进样器的把柄，直接把样品进到色谱柱的柱头。
4.2 在做标准曲线时，进样浓度应由低到高。
5 信号检测及数据处理
5.1 本系统用996型二极管阵列检测器，波长范围在190-800nm，接受全波长光谱。在分析过程中测定吸收信号由计算机进行处理，显示色谱图或光谱图，列出数据处理结果。测量结束时按规定退出程序后关机。
5.2 点灯，指示灯亮。诊断，检查校准。状态灯点亮，处于准备状态。稳定1小时后可以用于采集数据。
5.3 常规准备工作按色谱仪、检测器、打印机及计算机顺序接通电源。
5.4 进入Millennium32菜单，按Login，输入User Name and Pass Word后，按OK。
5.5 按Configure System进入子菜单，在建New chromatography System，先删旧的，单击Project ，建New chromatography System，选择所需要的W600，及检测器（PDA or ELSD）,输入System Name，按Finish。
5.5 使用Run Sample窗口可采集处理和报告数据
5.5.1 从Millennium32 登录窗口，双击Run Sample。
5.5.2 从Run Sample 对话框，选择色谱系统并单击确定，将建立BusLAC/E连接。
5.5.3 从菜单条中选择Edit>New Method Set单击Yes。
5.5.4 单击New Create以创建新仪器方法。屏幕上显示Edit Instrument Method。单击各仪器。
以编辑仪器参数，然后选择File>Save As以命名、标记（约束应用环境）并保存方法。然后选择File>Exit。
5.5.5 出现Select Instrument Method对话框。选择刚刚创建的方法，然后单击Next。向导将提示用户输入适用于方法的信息。
5.5.6 Method Set Editor对话框将出现。核实信息，然后选择File> Exit。
5.5.7 在Run Sample对话框中，单击Sample选项卡，在样品表中输入样品信息。使用水平滚动条访问每行中的所有信息。
5.5.8 单击工具条上的（Amounts），为各标准样品瓶输入组份名称和浓度。选择File> Exit，返回Run Sample。
5.5.9 核实运行模式是否设置

分
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