【讨论】微生物检测方法

这个不知道啊

1915年，McCrady首次发表了用MPN法 (最大可能数法) 来估算细菌浓度的方法， 这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法 [1]。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等的检测。因此了解MPN法的原理及局限性，对实验室的微生物检测及食品工业的微生物控制都有着重要的指导作用 。

1. MPN法的原理

因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可按概率理论计算菌数。如果每份接种样的细菌数平均值为Vl，每个接种管中进入k (k＝0、1、2……)个菌的概率Pn接近于泊松分布。

(1)

式中 V— 样本体积；
l — 样品中的细菌浓度，cfu/ml(g)；
当接种管全部为阴性时，即k = 0，则 Pn =
当取t组稀释度， 每组管数为ni (i = 1, 2, 3, ….) 时，细菌存在的概率为：

(2)

式中 pi — 第i组稀释度中的阳性管数。

例：当取3个稀释度，每组管数为3管时，细菌存在的概率为：

(3)

由(2)式求 ，并令 =0
此条件下求得的l值即为最大可能数(MPN)，对应的P为最大概率。



例：当取3个稀释度，每组管数为3管时，稀释度1 ml(g)，0.1 ml(g)，0.01ml(g)时，阳性
管数分别为2-0-0时，代入(3)式得：
(4)
P对l作图可得：

由(4)式求 ，并令 =0
得l ＝ 90 cfu/100 ml(g)，即MPN值为90 MPN/100 ml(g)；Pmax = 31.9 %；其95%的可置信区间为10~360 cfu/100 ml(g)。
具体含义：当阳性管数为2-0-0时，菌落浓度为90 cfu/100 ml(g)的可能性最大，其概率(P值)为31.9%；当置信度为95 %时，对应的菌落浓度区间为10~360 cfu/100 ml(g)。
3个连续稀释度，每组3个管，不同阳性管数组合对应的MPN值，最大概率值，95%可信区间见附录1。由附录1可见，部分阳性管数并没有列出对应的95%可信区间，是因为这些阳性管数对应的Pmax较小，95%可信区间范围过大，已失去了实际意义[2]。


2.2 MPN法的局限性
相同MPN值，但含义不同

阳性管数 MPN Pmax(%) 95%置信区间
1 ml(g)×3 0.1ml(g)×3 0.01 ml(g)×3 100 ml(g) 下限 上限
0 0 3 90 0.00000 － －
0 1 2 90 0.00035 － －
0 3 0 90 0.00417 － －
2 0 0 90 31.91613 10 360

例如，MPN值为90时，有四种不同情况的阳性管数。阳性管数为“0-0-0”“0-1-2”对应的最大概率(Pmax)极小，此时的MPN值 90 MPN/100 ml(g)无意义，所以在《FDA细菌学手册》中，已删除了这两种情况。阳性管数为“0-3-0” 对应的最大概率(Pmax)为0.00417%，而国标中并没有列出相应的95%置信区间，是考虑到该置信区间过广，已没有很大的指导意义。而阳性管数为“2-0-0”的最大概率(Pmax) 为31.91613%，表明实际的菌落数在10~360 cfu/100 ml(g)之间。
所以，测定MPN值时，要考虑阳性管数。相同的MPN值，代表的实际菌落数范围却有很大的差别。假如你的产品标准为100 MPN/100 g，实测值为90 MPN/100 g (阳性管数“0-3-0”)，那么很难判定你的产品是否合格。
MPN值非连续
在附录1的MPN表中，可见MPN值是不连续的。例如我国某些产品的大肠菌群标准为100 MPN/100 ml(g)或 450 MPN/100 ml(g)，但在MPN表中却没有相应的阳性管数。
MPN值的准确度随Pmax的减小而减小
在附录1的MPN表中，可见不同MPN值对应的Pmax值不同，且随着Pmax值的减小，MPN值的准确度也明显下降，所以在《FDA细菌学手册》中已删除了极低Pmax值(<0.004%)的情况，因为这些Pmax值对应的MPN值没有实际的指导意义[2]。
MPN法检测的隐性成本
MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的一种间接计数法。虽然实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在置信区间内的任何一点。
假如你产品的大肠菌群标准为30 MPN/100 g，而当你某个样品的检测结果为90 MPN/100 g，那么你可能会认为你的产品不合格。但是，让我们看一下90 MPN/100 g的置信区间，为10 ~ 360 cfu/100g，也就是说有部分结果为90 MPN/100 g的产品，且实际菌落数在10~30 cfu/100g之间，会被当作不合格产品处理。
另外，30 MPN/100 g的置信区间为<5~90 cfu/100 g (阳性管数0-0-1)或<5~130 cfu/100 g (阳性管数0-1-0)。也就是说部分实际菌落数为30~130 cfu/100g的产品，会被当作合格产品，从而微生物风险增加。

3. 直接计数法
MPN法是一种常见的间接计数法，但其存在一定的局限性。目前，以Petrifilm纸片法[3]、VRB(Violet Red Bile)平板法等直接计数法正越来越得到人们的广泛使用。
MPN法:适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品.

CFU(Colony Forming Units):1ml水样在营养琼脂培养基中,于37°C培养24h后所生长出来的细菌菌落总数. 指示被检水源水受有机物污染的程度，无菌要求高，时间长
两者都是检测的活菌数，但是CFU通过数据直接求数学期望，平均值和方差 MPN是通过极大似然估计，求出分布函数中的参数，置信区间，再估计。

The Most Probable Number Method